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主题：【第十二届原创】HPLC定性叶黄素及条件摸索

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色谱发烧友发表于：2019/10/31 14:35:24 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
维权声明：本文为m3248977原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。
10月三等奖

HPLC定性叶黄素及条件摸索



叶黄素属于类胡萝卜素，是一种天然、营养和多功能的食品添加剂，素有“植物黄金”之称。人体自身不能够合成叶黄素，只能够从食物中提取。叶黄素化学结构中有多个共轭双键，且碳链较长，查阅相关文献可知，叶黄素具有构型异构体和多种顺反异构体，其结构式如图1图2所示所示。



1. 样品的前处理

接收到的样品中仅含有15%的叶黄素，其余85%为油脂类。通过百度百科了解到叶黄素在溶剂中的稳定性为无水乙醇>乙酸乙酯>四氢呋喃>甲苯，首先准确称取23.6mg样品，尝试了一下100%的无水乙醇进行溶解，但是效果并不好，有沉淀产生。其次尝试了100%的THF进行溶解，效果很好能够完全溶解，但是考虑到样品的稳定性等因素，并经过不断尝试，最终采用无水乙醇：THF=2:1的比例进行溶解，尽可能少的使用THF，从而增加溶液的稳定性。

2.条件摸索

初始条件设置如下所示

                   

流动相

色谱柱

波长

流速

甲醇：水

安捷伦C18

446nm

1.0mL/min

通过查阅文献，使用上述条件进行测试时发现，无论怎么改变有机相比例，即使100%有机相都未见叶黄素出峰，色谱图及光谱图如下图3所示。


图3 接分离柱下色谱图及光谱图

从以上色谱图可以看出，只有系统倒峰及杂峰，结合3D光谱图在高波长446nm处未见吸收峰，由此可以判断样品未出峰，极有可能被牢牢地吸附在色谱柱中，因为通过叶黄素的几个结构式可以看出其碳链较长，与色谱柱中十八烷基的作用力较强，导致很难进行洗脱。为了进一步验证样品被吸附在色谱柱中，在其它条件不变的情况下，仅拆下色谱柱，用两通将管路连接，再进一针样品，色谱图及光谱图如下图4所示。

图4 不接分离柱下色谱图及光谱图

  由上图可以看出，在不接分离柱的情况下，在高波长处有吸收，那么可以确定C18柱对叶黄素的保留太强。接下来最直接的办法便是更换色谱柱了，将C18色谱柱换为碳链更短的C8柱进行分离，条件如下所示。

                   

流动相

色谱柱

波长

流速

甲醇：水

安捷伦C8

446nm

1.0mL/min

本以为换上C8色谱柱后，能够按照预期出峰，但是事与愿违！仍然无论怎么改变有机相比例，即使将甲醇比例增加为100%都不奏效，那么接下来只能通过改变流动相来降低其保留了。

考虑到极性水＞甲醇＞乙腈＞乙醇，那么我们可以通过降低流动相的极性，依据相似相溶来洗脱叶黄素，由于在配置样品时使用的是乙醇进行溶解，那么可以将极性很大的水相替换成极性较弱的乙醇，使用低极性的甲醇和乙醇的一个配比来将叶黄素进行分离。条件如下所示。

                   

流动相

色谱柱

波长

流速

甲醇：乙醇

安捷伦C8

446nm

1.0mL/min

按照上述条件，通过不断改变甲醇与乙醇的配比，终于叶黄素出峰！由于叶黄素有多个异构体，因此出的是一簇峰，色谱图及光谱图如下图5所示。


图5 叶黄素色谱图及光谱图

附件：
HPLC定性叶黄素及条件摸索.docx
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hujiangtao
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2019/10/31 14:52:10 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
叶黄素 胡萝卜素保留性太强不好做啊
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xiaogumd11
v3247983
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2019/10/31 15:25:11 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
感觉没有写完？
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天籁餘音
m3248977
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2019/10/31 15:25:28 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 hujiangtao(hujiangtao) 发表:
叶黄素 胡萝卜素保留性太强不好做啊
是的 最后只能用C8柱用乙醇才把它走出来
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天籁餘音
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2019/10/31 15:37:45 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 xiaogumd11(v3247983) 发表:
感觉没有写完？
写完了，留给看帖的讨论的空间
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zyl3367898
zyl3367898
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2019/11/3 22:30:49 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
光谱图是如何做出来的？是软件上带的吗？
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小不董
doxw0323
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2019/11/4 8:15:39 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
4.2-6min的出峰都是叶黄素？标样也是一簇峰吗？？
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天籁餘音
m3248977
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2019/11/10 12:01:24 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 小不董(doxw0323) 发表:4.2-6min的出峰都是叶黄素？标样也是一簇峰吗？？
是的呢，标样打进去也是一簇峰
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天籁餘音
m3248977
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2019/11/10 12:01:53 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 zyl3367898(zyl3367898) 发表:光谱图是如何做出来的？是软件上带的吗？
拍的3D光谱照片
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龙玉天堂
Insm_0cf638c2
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2020/6/11 14:59:38 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
5009.248不就可以做
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m3159092
m3159092
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2021/5/21 19:59:42 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
呵呵，楼主试试我的条件，446nm,C18柱子，250mm,5um,四氢呋喃：水57：43，V:V;
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