主题：【第二届网络原创参赛作品】HPLC维护全篇

第二篇    常见问题
高效液相色谱仪的几个使用问题
    1. 色谱柱中的流动相会排干吗？
    不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形：不慎未及时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸干了，HPLC系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱？泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了？色谱柱还能使用吗？事实上，如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干，并不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充满了空气，泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只能输送液体，而不能输送空气。相比之下，另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。同样，整个色谱柱干涸的情况不太容易发生，多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了，因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即使色谱柱真的变干了，也不一定就不可救药了。可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂（如经氦气脱气的甲醇）冲洗色谱柱以除去气体。较低的表面张力有助于浸润填料表面；已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。色谱柱大约需要（以1mL/min的流速）冲一个小时或更多的时间被彻底浸润，恢复到正常状态。
   
    2. 使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接头需要注意什么问题？
    如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱，使用PEEK材料制成的管路和接头会非常方便。PEEK管路容易连接；PEEK接头不仅无需工具，手拧即可固定，而且容易调节锥箍之外的管路长度，方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。
    使用此类材料的管路需要注意的是：PEEK对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。虽然未观察到上述溶剂溶解PEEK材料的明显迹象，但PEEK遇到上述溶剂会变脆。另一个西药考虑的因素是压力限。不锈钢管可耐受6000psi的压力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多数HPLC应用系统压力不会超过3000psi）。
    使用PEEK接头时则无需担心接头耐溶剂性能，因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。但手拧固定的PEEK接头压力限低于不锈钢管，因而压力太高时，可能会使接头在管路上滑动而产生死体积或漏液。
   
    3. 如何预防液相泵的故障:
    要保持泵的良好操作性能,必须维护系统的清洁,保证溶剂和试剂的质量,对流动相进行过滤和脱气.下面列出预防泵故障的几项措施:
    1).用高质量试剂和HPLC级溶剂；
    2）、过滤流动相和溶剂；
    3）、脱气；
    4）、每天开始使用时放空排气，工作结束后从泵中洗去缓冲液；
    5）、不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中；
    6）、定期更换垫圈；
    7）、需要时加润滑油；
    8）、查阅有关泵操作手册中的其它建议。
    处于良好操作状态的泵，应该能使色谱图上的基线平稳；保留时间的重复性好。在等度洗脱时压力波动小于2%。梯度洗脱时压力变化应是缓慢和平稳的。
    为了使故障发生后尽快排除，平时应常备密封、单向阀（入口与出口）、泵头装置、各式接头、保险丝等部件，以及更换工具。

第三篇    故障排除
HPLC故障及排除方法
诊状     可能的原因     解 决 方 法
(一)
保留时间变化    1.柱温变化    柱恒温
    2.等度与梯度间未能充分平衡    至少用10倍柱体积的流动相平衡柱
    3.缓冲液容量不够    用>25mmol/L的缓冲液
    4.柱污染    每天冲洗柱
    5.柱内条件变化    稳定进样条件,调节流动相
    6.柱快达到寿命    采用保护柱
(二)
保留时间缩短    1.流速增加    检查泵,重新设定流速
    2.样品超载    降低样品量
    3.键合相流失    流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向
    4.流动相组成变化    防止流动相蒸发或沉淀
    5.温度增加    柱恒温
(三)
保留时间延长    1.流速下降    管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡
    2.硅胶柱上活性点变化    用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱
    3.键合相流失    同前(二)3
    4.流动相组成变化    同前(二)4
    5.温度降低    同前(二)5
(四)

出现肩峰或分叉    1.样品体积过大    用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%
    2.样品溶剂过强    采用较弱的样品溶剂
    3.柱塌陷或形成短路通道    更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件
    4.柱内烧结不锈钢失效    更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品
    5.进样器损坏    更换进样器转子
(五)
鬼峰    1.进样阀残余峰    每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗
    2.样品中未知物    处理样品
    3.柱未平衡    重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)
    4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱)    每天新配,用抗氧化剂
    5.水污染(反相)    通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水
(六)

基线噪声    1.气泡(尖锐峰)    流动相脱气,加柱后背压
    2.污染(随机噪声)    清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂
    3.检测器灯连续噪声    更换氘灯
    4.电干扰(偶然噪声)    采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)
    5.检测器中有气泡    流动相脱气,加柱后背压
(七)
峰拖尾    1.柱超载    降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相
    2.峰干扰    清洁样品,调整流动相
    3.硅羟基作用    加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品
    4.同前(四)4    同前(四)4
    5.同前(四)3    5.同前(四)3
    6.死体积或柱外体积过大    连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管
    7.柱效下降    用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱
(八)
峰展宽    1.进样体积过大    同(四)1
    2.在进样阀中造成峰扩展    进样前后排出气泡以降低扩散
    3.数据系统采样速率太慢    设定速率应是每峰大于10点
    4.检测器时间常数过大    设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%
    5.流动相粘度过高    增加柱温,采用低粘度流动相
    6.检测池体积过大    用小体积池,卸下热交换器
    7.保留时间过长    等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱
    8.柱外体积过大    将连接管径和连接管长度降至最小
    9.样品过载    进小浓度小体积样品

第四篇    压力异常解决
压 力 异 常
操作压力的变化往往是故障的征兆。从下表中找出所观察到的现象，并在右侧的列表中参考相应的解决方法。
A、        没有压力显示，没有流动相流动
原 因    解决方法
1、电源问题    1、接通电源，开机
2、保险丝被烧坏    2、更换保险丝
3、控制器设定不正确或设定失败    3、a、采取恰当的设定
b、修理或更换控制器
4、柱塞杆折断    4、更换柱塞杆
5、泵头内有空气    5、溶剂脱气、启动泵抽出空气
6、流动相不足    6、a、补充流动相
b、更换入口滤头
7、单向阀损坏    7、更换单向阀
8、漏液    8、拧紧或更换手紧接头
B、        流动相流动正常，但没有压力显示
原 因    解决方法
1、仪表损坏    1、更换仪表
2、压力传感器损坏    2、更换压力传感器
C、        压力持续偏高
原 因    解决方法
1、流速设定过高    1、调整流速设定
2、柱前筛板堵塞    2、a、在允许情况下反冲色谱柱
b、更换筛板
c、更换色谱柱
3、流动相使用不当或缓冲盐的结晶沉淀    3、a、使用恰当的流动相
b、冲洗色谱柱
4、色谱柱选择不当    4、选择恰当的色谱柱
5、进样阀损坏    5、清洗或更换进样阀
6、柱温过低    6、提高温度
7、控制器失常    7、修理或更换控制器
8、保护柱阻塞    8、清洗或更换保护柱
9、在线过滤器阻塞    9、清洗或更换在线过滤器
D、        压力持续偏低
原 因    解决方法
1、流速设定过低    1、调整流速
2、系统漏液    2、确定漏液位置并维修
3、色谱柱选择不当    3、选择恰当的色谱柱
4、柱温过高    4、降低温度
5、控制器失常    5、维修或更换控制器
E、        压力不断上升
原 因    解决方法
1、见列表C    1、见列表C
F、        压力降为零
原 因    解决方法
1、见列表A、B    1、见列表A、B
G、        压力不断下降，但不回零
原 因    解决方法
1、见列表D    1、见列表D
H、        压力波动
原 因    解决方法
1、泵中有气体    1、a、溶剂脱气
b、从泵中除去气体
2、单向阀损坏    2、更换单向阀
3、泵密封损坏    3、更换泵密封
4、脱气不充分    4、a、溶剂脱气
b、改变脱气方法（使用在线脱气法等）
5、系统漏液    5、确定漏液位置并维修
6、使用梯度洗脱    6、由于流动相粘度的变化引起的压力波动

漏  液
通常可以通过拧紧或更换管路接头来解决漏液的问题。但值得注意的是过份拧紧会导致金属接头的漏液和塑料接头的磨损。如果通过稍微拧紧接头不能解决漏液的问题，就必须将接头取下，检查是否损坏（例如，卡套损坏、密封表面有杂质）；损坏的接头应该更换掉。
A、        接头处漏液
原 因    解决方法
1、接头松动    1、拧紧
2、接头磨损    2、更换
3、接头过紧    3、a、拧松，再重新拧紧
b、更换
4、接头被污染    4、a、拆下清洗
b、更换
5、部件不匹配    5、使用同一品牌的配件
B、        泵漏液
原 因    解决方法
1、单向阀松动    1、a、拧紧单向阀（不必拧的过紧）
b、更换单向阀
2、接头松动    2、拧紧接头（不必拧的过紧）
3、混合器密封损坏    3、a、更换混合器密封
b、更换混合器
4、泵密封损坏    4、维修或更换泵密封件
5、压力传感器损坏    5、维修或更换压力传感器
6、脉冲阻尼器损坏    6、更换脉冲阻尼器
7、比例阀损坏    7、a、检查隔膜，如果漏液立即更换
b、检查手紧接头，损坏的立即更换
8、放空阀的损坏    8、a、拧紧放空阀
b、更换放空阀
C、        进样阀漏液
原 因    解决方法
1、转子密封损坏    1、重新安装或更换进样阀
2、定量环阻塞    2、更换定量环
3、进样口密封松动    3、调整
4、进样针头尺寸不合适    4、使用恰当的进样针
5、废液管中产生虹吸    5、保持废液管高于废液液面
6、废液管阻塞    6、更换或疏通废液管
D、        色谱柱漏液
原 因    解决方法
1、尾端接头松动    1、拧紧接头
2、卡套内有填料    2、拆下、清洗卡套、重新安装
3、筛板厚度不合适    3、使用合适的筛板（参考下表）
筛板选择指导
物质粒径    筛板孔径
3-4u    0.5u
5-20u    2u
E、        检测器漏液
原 因    解决方法
1、流通池垫片损坏    1、a、避免过大的背景压力（压力降）
b、更换垫片
2、流通池窗破碎    2、更换窗口
3、手紧接头漏液    3、拧紧或更换
4、废液管阻塞    4、更换废液管
5、流通池阻塞    5、重新安装或更换
液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决；而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。
A、        峰拖尾
原 因    解决方法
1、筛板阻塞    1、a、反冲色谱柱
b、更换进口筛板
c、更换色谱柱
2、色谱柱塌陷    2、填充色谱柱
3、干扰峰    3、a、使用更长的色谱柱
b、改变流动相或更换色谱柱
4、流动相PH选择错误    4、调整PH值。对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰
5、样品与填料表面的溶化点发生反应图    5、a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂
b、更改色谱柱
B、        峰前延
原 因    解决方法
1、柱温低    1、升高柱温
2、样品溶剂选择不恰当    2、使用流动相作为样品溶剂
3、样品过载    3、降低样品含量
4、色谱柱损坏    4、见A1、A2
C、        峰分叉
原 因    解决方法
1、          保护柱或分析柱污染
图    1、取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞，拆下来清洗。如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。
2、样品溶剂不溶于流动相    2、改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。
D、        峰变形
原 因    解决方法
1、样品过载    1、减少样品载量
E、        早出的峰变形
原 因    解决方法
1、样品溶剂选择不恰当    1、a、减少进样体积
b、运用低极性样品溶剂
F、        早出的峰拖尾程度大于晚出的峰
原 因    解决方法
1、柱外效应    1、a、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路）
b、使用小体积的流通池
G、        K’增加时，脱尾更严重
原 因    解决方法
1、二级保留效应，反相模式    1、a、加入三乙胺（或碱性样品）
b、加入乙酸（或酸性样品）
c、加入盐或缓冲剂（或离子化样品）
d、更换一支柱子
2、二级保留效应，正相模式    2、a、加入三乙胺（或碱性样品）
b、加入乙酸（或酸性样品）
c、加入水（或多官能团化合物）
d、试用另一种方法
3、二级保留效应，离子对    3、加入三乙胺（或碱性样品）
H、        酸性或碱性化合物的峰拖尾
原 因    解决方法
1、缓冲不合适    1、a、使用浓度50-100mM的缓冲液
b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液
I、            额外的峰

原 因    解决方法
1、样品中有其他组份    1、正常
2、前一次进样的洗脱峰    2、a、增加运行时间或梯度斜率
b、提高流速
3、空位或鬼峰    3、a、检查流动相是否纯净
b、使用流动相作为样品溶剂
c、减少进样体积
J、          保留时间波动
原 因    解决方法
1、温控不当    1、调好柱温
2、流动相组分变化    2、防止变化（蒸发、反应等）
3、色谱柱没有平衡    3、在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱
K、        保留时间不断变化
原 因    解决方法
1、流速变化    1、重新设定流速
2、泵中有气泡    2、从泵中除去气泡
3、流动相选择不恰当    3、a、更换合适的流动相
b、选择合适的混合流动相
L、        基线漂移
原 因    解决方法
1、柱温波动。（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。）    1、控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器
图
2、流动相不均匀。（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。）    2、使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。
3、流通池被污染或有气体    3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用盐酸）
4、检测器出口阻塞。（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）    4、取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。
5、流动相配比不当或流速变化    5、更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。
6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时    6、用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成    7、检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂
8、样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。    8、使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。
9、使用循环溶剂，但检测器未调整。    9、重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。
10、检测器没有设定在最大吸收波长处。    10、将波长调整至最大吸收波长处
M、      基线噪音（规则的）
原 因    解决方法
1、在流动相、检测器或泵中有空气    1、流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。
2、漏液
图    2、见第三部分。检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封。
3、流动相混合不完全    3、用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂
4、温度影响（柱温过高，检测器未加热）    4、减少差异或加上热交换器
5、在同一条线上有其他电子设备    5、断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。
6、泵振动    6、在系统中加入脉冲阻尼器
N、        基线噪音（不规则的）
原 因    解决方法
1、          漏液
图    1、见第三部分。检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换密封。检查流通池是否漏液。
2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成    2、检查流动相的组成。
3、流动相各溶剂不相溶    3、选择互溶的流动相
4、检测器/记录仪电子元件的问题    4、断开检测器和记录仪的电源，检查并更正。
5、系统内有气泡    5、用强极性溶液清洗系统
6、检测器内有气泡    6、清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器
7、流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音。）    7、用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池
8、检测器灯能量不足    8、更换灯
9、色谱柱填料流失或阻塞    9、更换色谱柱
10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常    10、维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置
O、        宽峰
原 因    解决方法
1、流动相组成变化    1、重新制备新的流动相
2、流动相流速太低    2、调节流速
3、漏液（特别是在柱子和检测器之间）    3、见section 3。检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。如果必要更换密封。
4、检测器设定不正确    4、调整设定
5、柱外效应影响
a、柱子过载
b、检测器对反应时间或池体积响应过大
c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大
d、记录仪响应时间太长
图    5、
a、 小体积进样（例如：10ul而不是100ul）以1：10或1：100的比例稀释样品
b、减少响应时间或使用更小的流通池
c、 使用内径为0.007-0.01的短管路
d、减少响应时间
6、缓冲液浓度太低    6、增加浓度
7、保护柱污染或失效    7、更换保护柱
8、色谱柱污染或失效，塔板数较低    8、更换同样类型的色谱柱。如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子。
9、柱入口塌陷    9、打开柱入口，填补塌陷或更换柱子
10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰    10、选择其它类型的色谱柱以改善分离效果
11、柱温过低    11、提高柱温。除非特殊情况，温度不宜超过75℃
12、检测器时间常数太大    12、使用较小的时间常数
P、        分离度降低
原 因    解决方法
1、流动相污染或变质（引起保留时间变化）    1、重新配置流动相
2、保护柱或分析柱阻塞
图    2、去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞，可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。
Q、        所有的峰面积都太小
原 因    解决方法
1、检测器衰减设定过高    1、减少衰减的设定
2、检测器时间常数设定太大    2、设定较小的时间常数
3、进样量太少    3、增大进样量
4、记录仪连接不当    4、使用正确的连接
R、        所有的峰面积都太大
原 因    解决方法
1、检测器衰减设定过低    1、采取较大的衰减
2、进样过多    2、减少进样量
3、记录仪连接不正确    3、正确连接记录仪
以下问题在使用进样阀过程中有可能发生。
A、        手动进样阀，转动不灵
原 因    解决方法
1、转子密封损坏    1、更换或调整转子密封
2、转子太紧    2、调整转子的松紧度
B、        手动进样阀，载样困难
原 因    解决方法
1、进样阀安装不当    1、重新安装
2、定量环阻塞    2、清洗或更换定量环
3、进样器污染    3、清洗或更换进样器
4、管路阻塞    4、清洗或更换管路
C、        自动进样阀，不能转动
原 因    解决方法
1、无压力（或电源）    1、提供恰当的压力（电源）
2、转子太紧    2、调整转子的松紧度
3、进样阀安装不当    3、重新安装
D、        自动进样阀，其它问题
原 因    解决方法
1、阻塞    1、清洗或更换阻塞部件
2、机械故障    2、见随机维修手册
3、控制器故障    3、维修或更换控制器
由气味、景象和声音可以发现的问题
你需要运用你所有的感官去发现液相色谱的问题。你最好养成习惯，每天花上几分钟运用你的感官（除了味觉）来“感觉”你的液相色谱是否存在问题，这样可以帮助你迅速找到问题所在。例如：在你看到漏液之前，你可能首先闻到它的气味。大部分的问题是可以通过眼睛看到。
A、        溶剂的气味
原 因    解决方法
1、漏液    1、见section 3
2、溅出    2、a、检查废液瓶是否已满
b、找到溅出的部位并清洗干净
B、        热气味
原 因    解决方法
1、仪器过热    1、a、检查并调节通风设施
b、检查并调节温度设定
c、关掉仪器，查找维修手册
C、        读数不正常
原 因    解决方法
1、压力不正常    1、见section 2
2、柱温箱问题    2、
a、检查并调节设定
b、参照用户手册
3、检测器灯失效    3、更换灯
D、        灯警告
原 因    解决方法
1、压力超出极限值    1、
a、检查是否阻塞
b、检查并调节极限值的设定
2、其它警示灯    2、见用户手册
E、        警告音
原 因    解决方法
1、溶剂泄漏/溅出    1、找到并解决
2、其它警告音    2、见用户手册
F、        刺耳的短音或长音
原 因    解决方法
1、轴承失效    1、见用户手册
2、润滑不够    2、进行恰当的润滑
3、机械故障    3、见用户手册
常见故障及日常维护
下表中列出了液相色谱常见的一些问题，右侧中则列出的日常维护的方法可以减少问题出现的频率。括号中的数字是建议进行维护的时间间隔。用户手册则提供您更多的维护方法。
溶剂瓶
问 题    维 护
1、进口筛板阻塞    1、
a、更换（3-6个月）
b、过滤流动相，0.5u滤膜
2、气泡    2、流动相脱气
泵
问 题    维 护
1、气泡    1、流动相脱气
2、泵密封损坏    2、更换（3个月）
3、单向阀损坏    3、过滤流动相，运用在线过滤，准备备用单向阀
进样阀
问 题    维 护
1、转子密封损坏    1、
a、不要拧的过紧
b、过滤样品

第五篇    常见问题解决

关于HPLC的常见问题及解答
一、问:用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在？如何解决？
答:关于漂移问题：
1． 温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定
2． 流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等
3． 柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡
关于快速变化问题
1． 流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定
2． 泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。
3． 流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合
二、问:液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？</B>
答: 1． 筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。
2． 存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子
三、问：HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法</B>
答: 1． 样品量不足，解决办法为增加样品量
2． 样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子
3． 样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器
4． 检测器衰减太多。调整衰减即可。
5． 检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数
6． 检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。
7． 检测池中有气泡。解决办法为排气。
8． 记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。
9． 流动相流量不合适。调整流速即可。
10． 检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
四、问：做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？</B>
答：原因可能有：
1． 泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；
2． 比例阀失效，更换比例阀即可；
3． 泵密封垫损坏，更换密封垫即可；
4． 溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；
5． 系统检漏，找出漏点，密封即可；
6． 梯度洗脱，这时压力波动是正常的。
五、问：我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？</B>
答：柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。
1． 拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；
2． 把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；
3． 将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；
4． 更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。 一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的Rheodyne 7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。

第六篇    清洗总结
HPLC系统的酸清洗和钝化
30％磷酸水溶液通过酸反应和强表面活性剂／洗涤剂的共同作用，可以有效地清洁不锈钢及其它润湿的部件。这一方法比更常用的硝酸“钝化”绝对更有效、且较少损害(特别是对日常使用低紫外波长的应用来说)。这一磷酸清洗步骤不是起钝化作用，但它是系统钝化前清洗的第一步。一般来说，对于阳离子的离子色谱分析或配有氧化方式的电化学检测器以外的应用不需要钝化系统。因为有真空脱气机(每个通道体积为8m1)，可不必用磷酸；中洗全部通道。如果你计划四个通道都要用，则可用湿灌注的方式以4mL／min流速对每个通道清洗8～1 O分钟来清洗脱气机。这一步完成后你必须彻底淋洗管路，用水淋洗2～3次以便将磷酸从溶剂过滤头等部件冲洗净。
安装好的H P L C系统的酸清洗和钝化
HPLC系统内部可能的污染物来自人的触摸，暴露在实验室化学环境，与零部件制造相关的残留物，或来自先前的流动相和样品的残余物。
虽然系统自身也会逐步地被流动相清洗，但某些释放出的杂质会吸附在色谱柱上以及检测器润湿的表面上，因而会降低总的性能。
•磷酸清洗：
通常用于从系统中除去有机杂质。可能是由于洗涤作用，它似乎比强有机溶剂更好也更快。这一步清洗必须在硝酸钝化之前完成。
•硝酸钝化：
实际上是作用于不锈钢表面，在表面上生成均匀的氧化层。这层氧化膜保护不锈钢免受腐蚀(卤化物，螯合剂，等等)并且尽量减少浸出的金属离子进入流动相。
以下应用需要在使用前做磷酸清洗和硝酸钝化，包括：
•所有的氨基酸分析系统
•所有包含电化学检测器的系统
•所有要分析无机阳离子，包括过渡金属的系统
•所有利用柱后添加衍生试剂或络合样品组分的系统
以下应用需要在使用前只做磷酸清洗，包括：
•所有常规用途的、可能在低pH环境下在低紫外检测波长下运行的HPLC系统
•所有需要高灵敏度性能的梯度紫外检测系统
系统清洗指南：
注意：在实行这个程序时采用适当的安全防护措施
准备工作：
首先，摘下色谱柱，用两通或接头取代色谱柱。在实行这一清洗步骤时，如果有可能选择监测的紫外波长为：254nm。通过软件或移去电缆的方式取消紫外检测器的自动回零功能。
具体步骤：
1、用甲醇彻底冲洗系统，以等比例方式通过泵的所有管路。
2、用水彻底冲洗系统，以等比例方式通过泵的所有管路。
3、以等比例方式通过泵的所有管路导入～30％v／v磷酸水溶液。以1mL/min流速洗大约一个小时。在冲洗期间活动所有的阀，包括：参比阀、进样阀及旁路阀等等。
4．用水彻底冲洗所有管路和系统。
必要时用6N硝酸(HN03)重复以上步骤。否则，跳到第7步。注意：硝酸是一个强紫外吸收溶液。除非绝对需要，不要做钝化程序
5．以等比例方式通过泵的所有管路导人6N硝酸水溶液(大约是40％)。以1mL/min流速洗大约一个小时。
6．用水彻底冲洗系统，仔细检查是否有任何渗漏，在冲洗期间反复活动所有的阀，包括：参比阀、进样阀及旁路阀等等。
注意：如果你要用低于270nm的紫外波长作检测，则需要更大量水的清洗过程，不断的换新鲜水并活动各个阀(冲洗进样器，等)以便从系统中除去所有的痕量硝酸根离子。硝酸清洗后经常在几天之内都会观察到在低紫外波长下有负的基线漂移。勤换水和有耐心是尽快消除紫外本底的关键。
7．返回到甲醇洗，然后继续用实验所需的溶剂冲洗。
8．通过软件或接上电缆的方式重新使紫外检测器的自动回零功能恢复。[

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