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发表于：2011/09/09 14:44:17 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

生物祥品分析前处理技术
生物样品的前处理涉及很多方面，但主要应考虑生物样品的种类，被测定药物的性质和测定方法三个方面的问题。
样品的分离、纯化技术应该依据生物样品的类型。例如，血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出；唾液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白；尿液样品常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出，当原型药物排泄在尿中时，可简单地用水稀释一定倍数后进行测定。
根据被测定药物的结构、理化及药理性质、存在形式、浓度范围等，采取相应的前处理方法。例如，药物的酸碱性（pka）、溶解性质涉及到药物的提取手段；是否具有挥发性涉及到能否采用气相色谱法测定；药物的光谱特性及官能团性质涉及到分析仪器的选择、能否制成衍生物及应用特殊检测器的可能性。药物在样品中的浓度相差很大，浓度大的样品，对前处理要求可稍低；浓度越低则样品前处理要求越高。此外，药物在体内常产生许多代谢产物，其中一些代谢物仍具有药理活性，需要与原型药分别测定，因而也要了解药物的药理学性质和药物动力学特性。
样品于测定前是否需要纯化以及纯化到什么程度均与其后采用的测定方法的不同而不同。即纯化程度与所用测定方法的专属性、分离能力、检测系统对不纯样品污染的耐受程度等密切相关。一般说来，放射免疫测定法由于具有较高的灵敏度和选择性，因此当初步除去主要干扰物质之后即可直接测定微量样品；而对灵敏度和专属性较差的紫外分光光度法，分离要求就要相应高一些；至于常用的高效液相色谱法，为防止蛋白质等杂质沉积在色谱柱上，上柱前需对生物样品进行去蛋白，有时对被测组分进行提取、制备衍生物等前处理。下图大致反映了检测方法与样品前处理要求的相三关系。
样品处理步骤与分析方法的选择
（一）去除蛋白质
在测定血样时，首先应去除蛋白质。去除蛋白质可使结合型的药物均出来，以便测定药物的总浓度；去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性能（如保护HPLC柱不被沾污），延长使用期限。去除蛋白法有以下几种。

1.加入与水相混溶的有机溶剂加入水溶性的有机溶剂；可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。常用的水溶性有机溶剂有：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1：（1～3）时，就可以将90％以上的蛋白质除去。水溶性有机溶剂的种类不同时，析出的蛋白质形状亦不同；并且所得上清液的pH值也稍有差别，如用乙腈或甲醇时，上清液pH为8.5～9.5，用乙醇或丙酮时，上清液pH为9～10。操作时，将水溶性有机溶剂与血浆或血清按一定比例混合后离心分离，取上清液作为样品。通常分离血浆或血清用的离心机（3000r/min）不能将蛋白质沉淀完全，而采用超速离心机（10000r／min）离心1～2min便可将析出的蛋白质完全沉淀。离心时应用超速离心机专用的具塞塑料尖底管，可使析出的蛋白质牢固地粘在管底，便于上清液的吸取。

2.加入中性盐加入中性盐，使溶液的离子强度发生变化。中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。操作时，如按血清与饱和硫酸铵的比例为1：2，混合，离心（10000r/min）1～2min，即可除去90％以上的蛋白质。所得上清液的pH为7.0～7.7这种利用盐析的方法与有机溶剂提取法并用时，药物的回收率高，因而常常被采用。

3.加入强酸当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在。此时加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶住盐而沉淀。常用的强酸有：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸-钨酸混合液及5％偏磷酸等。含药物血清与强酸的比例为1：0.6混合，离心〈10000r／min）1～2min，就可以除去90％以上的蛋白质。取上清液作为样品。因加入了强酸，上清液呈酸性（pH0～4），在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。过量的三氯醋酸可经煮沸，分解为氯仿和二氧化碳而被除去；也有用乙醚提取过量三氯醋酸的方法。过量的高氯酸可用碳酸钾、醋酸钾、氢氧化钠等中和，然后加乙醇使产生的高氯酸钾（钠）沉淀而被除去。偏磷酸及硫酸-钨酸可用同法除去。

4.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用的沉淀剂有CuSO4-NaWO4、ZnSO4-NaOH等。离心分离后所得的上清液pH分别为5.7～7.3和6.5～7.5。

5.酶解法在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用酶解法。最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。它不仅可使组织酶，并可使药物析出。枯草菌溶素是一种细菌性碱性蛋白分解酶，可在较宽的pH活圈（PH7.0～11.0）内使蛋白质的肽键降解，在50～60℃具有最大活力。
酶解法操作简便。先将待测组织加Tris-缓冲液（pH 10·5）及酶，60℃培育1h，用玻璃棉过滤，得澄清滤液，即可供药物提取用。
酶解法的优点是：可避兔某些药物在酸及高温下降解：对与蛋白质结合牢的药物（如保泰松、苯妥英纳），可显著改善回收率；可用有机溶剂直接提取酶解液而无乳化现象生成，当采用HPLC法检测时，无需再进行过多的净化操作。酶解法的主要问题是不适用于在碱性下易水解的药物。

（二）缀合物的水解
尿中药物多数呈缀合状态。一些含羟基、羧基、氨基和巯基的药物，可与内源性物质葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸甙缀合物；还有一些含酚羟基、芳胺及醇类药物与内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物。由于缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取。为了测定尿液中药物总量，无论是直接测定或萃取分离之前，都需要将缀合物中的药物释出。有些药物仅需较温和条件即可使药物游离，有些则需较剧烈的方法，常用酸水解或酶水解的方法。
酸水解时，可加入适量的盐酸液。至于酸的用量和浓度、反应时间及温度等条件，随药物的不同而异，这些条件应通过实验来确定。
对于遇酸及受热不稳定的药物，可以用酶水解法。常用葡萄糖醛酸甙酶或硫酸酯酶或葡萄糖醛酸甙硫酸酯酶的混合酶。酶水解很少使被测药物或共存物发生降解。虽然酶水解的时间较常，以及由酶制剂带入的粘液蛋白可能导致乳化及色谱柱顶部阻塞的缺点，但仍被优先选用。

（三）分离、纯化与浓集
不管分析目的是什么，其选择性是相当重要的。这是因为内源性物质、代谢物或其它药物的干扰能影响分析结果。
对于大多数药物而言，生物样品的分析通常由两步组成：样品的前处理（分离、纯化、浓集）和对最终提取物的仪器分析。前处理是为了除去介质中含有的大量内源性物质等杂质，提取出低浓度的被测药物，同时浓集药物或代谢物的浓度，使其在所用分析技术的检测范围之内；分析的专属性也有部分取决于仪器分析这一步骤，但主要仍是样品的前处理。
提取法是应用最多的分离、纯化方法。提取的目的是为了从大量共存物中分离出所需要的微量组分----药物及其代谢物，并通过溶剂的蒸发使样品得到浓集。提取法包括液-液提取法和液-固提取法。
1.液-液提取法（liquid-liquid extraction，LLE）多数药物是亲脂性的，在适当的溶剂中的溶解度大于水相中的溶解度，而血样或尿样中含有的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质。因而用有机溶剂提取一次即可除去大部分杂质，从大量的样品中提取药物经浓集后作为分析用样品。
应用本法时要考虑所选有机溶剂的特性、有机溶剂相和水相的体积及水相的pH值等。
对所选用的有机溶剂，要求对被测组分的溶解度大：沸点低，易于浓集、挥散；与水不相混溶以及无毒、化学稳定、不易乳化等。最常用的溶剂是乙醚和氯仿等。
提取时所用的有机溶剂要适量。一般有机相与水相（体液样品）容积比为1：1或2：1。根据被测药物的性质及方法需要，可从实验中考察其用量与测定响应之间的关系，来确定有机溶剂的最佳用量。
PH的影响在溶剂提取中十分重要。水相的pH随药物的理化性质的不同而异，但生物样品一般多在碱性下提取。这是因为多数药物是亲脂性的碱性物质，而生物样品中的内源性物质多是酸性的，一般不含脂溶性碱性物质，所以在碱性下用有机溶剂提取时内源性杂质不会被提取出来。曾有人将空白血清分别与pH2、pH7、及PH13的缓冲液混后用乙醚提取，提取液用RP-HPLC（UV-220nm检测）测定色谱图时（图），发现在碱性（pH13）下提取液的杂质峰最少，而在中性及酸性下杂质峰显著多而强。
当一些碱性药物在碱性pH不稳定时，则在近中性pH处用氯仿和异丙醇提取。而中性药物则在pH7附近提取（愚然它可在任一pH被提取）。
提取时于水相（体液样品）中加入有机溶剂后，一般只提取一次。个别情况下（如杂质不易除去），则须将第二次提取分离出的含药有机相，再用一定pH的水溶液反提取（back extraction），然后再从水相将药物提取到有机相。
液-液提取法的优点在于它的选择性，这是依赖于有机溶剂的选择；药物能与多数内源性物质分离；而且在使用非专属性的光谱法分析时，这是一个很大的优点。例如，如果一个亲脂性药物的代谢程度很大，它的代谢物与母体化合物具有同样的发色团，这些代谢物将极大地干扰测试。但如果采用一亲脂性溶剂进行提取，该药物能被选择性地提取，而将相对极性大的代谢物留在生物体液中。如果是色谱法，则可利用亲水性溶剂提取药物和代谢物，从而达到分离并共同测定的目的。但是，液-液提取法并不是适用于所有化合物。例如，极性大的药物通常不能用该法提取，但使用离子对试剂，（ion pair reagent）的离子对提取法（impair extraction method），能够将液-液提取法的应用扩展到这类药物中。
液-液提取法的缺点在于乳化现象的产生。乳化作用能引起药物的损失，从而导致较低的回收率。，通常采用较大体积的提取用溶剂或温和的混合方法能克服乳化现象。如果采用相对于样品体积较大体积的溶剂进行提取，在后续步骤中，需将被测组分浓集。
离子对提取法是一种用有机溶剂提取离子性药物的方法。其原理为：一些酸性或碱性的有机药物在体液中呈离解状态，变成亲水性极强的带电荷离子，即使控制pH值也不能抑制它们的电离，使其不能用有机溶剂从体液中提取出来。对于呈离解状态的药物，当添加与药物离子呈相反电荷的反离子（counter ion）时，即可成为具有一定脂溶性的离子对，用有机溶剂将其从水相中提取分离。
　　　　ＤＱ为分配比，表示药物在有机相和水相中的摩尔比值，其值越大，提取到有机相中的药物量越多。由式可知，ＤＱ值的大小是由提取常数ＥＱＸ和水相中的反离子浓度［Ｘ-］ａｑ决定的。此外，还于反离子及提取溶剂的种类有关，选择合适的离子对试剂可提高ＥＱＸ值，有利于离子对的提取；欲提高药物萃入有机相中的量，应选择对离子对试剂溶解度大的有机溶剂。测定碱性药物时，一般用十二烷基磺酸类（RSO3H）作为反离子，如戊烷磺酸、己烷磺酸、庚烷磺酸、辛烷磺酸、月桂磺酸等；测定酸性药物时，一般用烷基季铵类化合物（R4N+X-）作为反离子，如四丁基铵、、四乙基铵、四辛基铵等。常用的提取溶剂为氯仿、二氯甲烷等。体液中呈阴离子状态的药物及代谢物主要是有机胺类，尤其是季铵类药物，其碱性很强，不能通过控制ｐＨ值来抑制其电离，可与烷基磺酸类反离子物质形成离子对，然后用有机溶剂提取。
　　２.液-固提取法（liquid-solidｅｘｔｒａｔｉｏｎ，ＬＥＳ）　液－固提取法是近十几年来在纯化生物样品时被广泛采用的方法。也可以认为是规模缩小的柱色谱法。这种方法是应用液相色谱法原理处理样品。将具有吸附、分配及离子交换性质的、表面积大的担体作为萃取剂填入小柱，以溶剂淋洗后，将生物样品通过，使其药物或杂质保留在担体上，用适当溶剂洗去杂质，再用适当溶剂将药物洗脱下来。
　　与LLE相比较，ＬＳＥ具有如下优点：ＬＳE较少引入杂质；消除了LＩＥ的主要缺陷――乳化现象；提取效率高；可用少量生物样品进行分析（如50~100ul的血浆样品）；柱为可弃型，废弃物易从实验室移走；再最后洗脱中多采用以水为主的溶剂系统，大大增加了安全型；最大的优点为处理样品速度快、并在室温下操作，尤其适用于处理挥发性及对热不稳定药物。
常用于填充柱的担体大致分为两类：
第一类为亲水性的硅藻土等，它可以捕集全部样品，即样品全部吸附在担体颗粒表面，形成一薄层，然后采用一种与水不相混溶的有机溶剂倾入柱中，即可分离药物。
第二类常用疏水性的活性炭、聚苯乙烯或Ｃ１８化学键硅胶等，它们可从样品中吸附亲脂性药物，然后用有机溶剂分离药物。如填充离子交换树脂，可用于高极性、能电离药物的分离。
在过去的十多年中，ＨＰＬＣ法色谱柱填充物的种类与数目迅速扩大，这给生物样品的液－固提取前处理法的发展带来了契机，各生产厂家制备出各种微型柱已在广泛地用作固体提取剂。其中有的供手工操作，也有供自动化设备的。
（１）液－固提取法的手工操作法：从市场上可得到含不同吸附剂的微型柱。如由美国Analytichem International公司生产的 Bond Elut和由美国 Waters公司生产的 Sep-pak微型柱等，目前应用最广泛。两种微型柱示意图见图
样品室　聚丙烯管壁　聚乙烯多孔圆盘　吸附剂床　聚乙烯多孔圆盘
将样品溶解在适当的溶剂中，加到微型柱上端，在下端通过负压使溶剂流动，商品生产者已生产出“真空集合管”“自动离心式样品萃取器”等，能同时分析操作8～10个微型柱。也可以通过在微型柱的上端利用注射器达到正压或用离心的方法使溶剂流动。洗脱出的分析样品在每一微型柱的正下方用试管收集。
微型柱使用的一般步骤：
步骤１：用有机溶剂如甲醇，预先湿润微型柱，使增加填料与待测物相互作用的表面积，并可除去可能干扰分析的填料残留物。
步骤２：用色谱纯的水或合适的溶剂冲洗，除去过多的甲醇，并为样品提供表面积。
步骤３：进样，通过微型柱废液弃去。
步骤４：用水或合适溶剂洗柱，选择性地除去将会干扰后面色谱分析的内源性杂质步骤用合适的溶剂洗脱样品，收集，洗脱液用于后面的分析测定或进一步研究。
Bond Elut微型柱采用各种极性、非极性硅胶键合填料，Sep－pak系列有C18硅胶、硅酸镁、氧化铝等四种填料。
（２）自动化液固提取法：１９８３年出现了半自动样品制备系统（advanced automated sample processer,　AASP，高级自动化样品处理机，Varian公司），使液－固提取法更加简便、快速。这种半自动样品制备系统能使被分析物从固定相洗脱。其制备方法包括：样品经过10个固定填充微柱的离线萃取后，填充微柱被转移到自动进样器作为预柱，其流动相可将被分析物洗脱至分析柱。此法分析物损失小且分析快速。但样品的制备和分析仍然是两个分开的过程。
AASP经过两条途径进行了进一步的自动化：一种是采用机器手，另一种是采用带有探头的自动进样器。机器手主要使人工的样品必理过程自动化。因为AASP的填充微柱必须被人工转移到也谱系统，故此法仍是离钱分析。第二种方法是自动进样器与AASＰ阀门的清洗接头处连接，从而实现了被分析物被自动洗脱到分析柱前、固相活化样品添加和填充微柱清洗的在线联用。
3.被测组分的浓集样品在提取过程中，虽然被测组分得到了纯化，但因微量的组分分布在较大体积（数毫升）的提取溶剂中，提取液往往还不能直接进行分析。一些分析方法如ＧＣ法和ＨＰＬＣ法等都受到进样量的限制，若将提取液直接注入仪器，被测组分量可能达不到检测灵敏度，因此，常需要使组分浓集后再进行测定。
浓集的方法主要有两种：一种方法是在末次提取时加入的提取液尽量少，使被测组分提取到小体积溶剂中，然后直接吸出适量供测定。另一种方法是挥去溶剂时应避免直接加热，防止被测组分破坏或挥失。挥去提取溶剂的常用方法是直接通入氮气流吹干；对于易随气流挥发或遇热不稳定的药物，可采用减压法挥去溶剂。
溶剂蒸发所用的试管，底部应为尖锥型，这样可使最后数毫升溶剂集中在管尖，便于量取。
近年来，许多学者在研究工作中利用了柱切换技术，生物样品不用溶剂而直接进行分析。这时ＨＰLC仪用来进行样品的制备（前处理）和分析，其色谱系统由一个预柱和一个分析柱组成。采用柱切换技术，在样品进入分析柱进行分离分析之前，将样品在预柱土进行痕量富集。样品进入预柱，预柱保留被测组分，而将杂质冲入废池（图），进一步冲洗预柱使样品更洁净（图3b），被测组分被反冲出预柱进入分析柱（图3a）用ＵＶ法、荧光法或电化学法进行最终定量。整个过程是自动化进行的，从开始进样直到数据、报告都由微处理器控制。
这是一种连接柱的应用技术。即将液－固提取微型柱作为预柱与ＨＰＬＣ仪连接，增加一个泵，先将样品流经预柱，使起到纯化与富集作用，再经分析柱，能提高分析的灵敏度。
采用此系列，预柱可被多次利用（如每次１００ｕｌ血浆可注射１５０次）
（四）化学衍生化
分离前将药物进行化学衍生化的目的是：（１）使药物变成具有能被分离的性质；（２）提高检测灵敏度；（３）增强药物的稳定性；（４）提高对光学异构体分离的能力等。
药物分子中含有活泼Ｈ者均可被化学衍生化，如含有－ＣＯＯＨ、－ＯＨ、ＮＨ２、、－ＮＨ－、－ＳＨ等官能团的药物都可被衍生化。
化学衍生化对GC和ＨＰＬＣ尤为重要。
１.ＧＣ中化学衍生化法　　药物的化学衍生化前处理对ＧＣ十分必要，衍生化可使药物分子中的极性基团，如羟基、氨基、羧基等变成无极性的、易于挥发的药物，从而使ＧＣ的温度不必很高即可适合ＧＣ的分析要求。主要的衍生化反应有烷基化（alkylations）、酰化（acrylations）、硅烷化（silylations）等。其中已硅烷化用得最广泛。
常用的烷基化试剂有碘甲烷（ＣＨＩ）、叠氮甲烷（ＣＨＮ２）、氢氧化三甲基苯胺（ＴＭＡＨ）等；常用得酰化试剂有：乙酸酐、丙酸酐等；硅烷化试剂有：三甲基氯硅烷（ＴＭＣＳ）、双－三甲基硅烷乙酰胺（ＢＳＡ）、双－三甲基硅烷三氟乙酰胺（ＢＳＴＦＡ）、三甲基硅烷咪唑（ＩＭＴＳ）等。
具有光学异构体的药物，由于R（-）与S（＋）构型不同，使之具有不同的药效和药动学特性，因此，异构体的分离也是十分重要的。分离光学异构体的方法之一，就是采用不对称试剂，使其生成非对映异构体衍生物，然后用GC法或HPLC法进行分析测定。常用的称试剂有：（Ｓ）－Ｎ－三氟乙酰脯胺酰氯、（Ｓ）－Ｎ－五氟乙酰脯胺酰氯等。
２.ＨＰＬＣ中化学衍生化法　　当采用HPLC法时，其衍生化的目的是为了提高药物的检测灵敏度。一些在紫外、可见光区没有吸收或者摩尔吸收系数小的药物，可以使其与衍生成对可见－紫外检测器、荧光检测器及电化学检测器等具有高灵敏度的衍生物。
化学衍生化包括柱前衍生化和柱后衍生化两种方法。由于柱前衍生化法是在分离前使药物与衍生化试剂反应，故与药物具有相同官能团的杂质也会同样生成衍生，这样就有可能妨碍药物的检测。同时，如果杂质含量多时，药物与衍生化试剂的反应率降低，因此，应尽可能将药物进行精制后再衍生化。柱后衍生化是药物经色谱柱分离之后进行的，所以可形成对检测器具有高灵敏度的衍生物，从而提高了选择性。ＨＰＬＣ常用的衍生化试剂有邻苯二醛、丹酰氯、荧胺等。
　
1. 测定方法的效能指标
　　任何一种分析测定方法，根据其使用的对象和要求，都应有相应的效能指标。一般，常用的分析效能评价指标包括：精密度、准确度、检测限、定量限、选择性、线性与范围、重现性、耐用性等；对于生物样品中药物分析方法评价的标准与上述的评价指标相比较，有共同之点也有特殊的要求。测定方法的效能指标可以作为对分析测定方法的评价尺度，也可以作为建立新的测定方法的实验研究依据。下面分别作简要、介绍：
一、精密度
　　精密度（precision）系指用该法测定同一匀质样品的一组测量值彼此符合的程度。它们越接近就越精密。在药物分析中，常用标准差（S）或相对标准差（RSD）表示：
1．标准（偏）差（standard deviation，SD或S）
2．相对标准（偏）差（rdative standard deviation，RSD），也称变异系数（coefficient of　variation，CV）。
生物样品分析时，常用RSD表示精密度，并可细分为批内（或日内）精密度及批间（或日间）精密度。
　　批内精密度（within－run precision）：是同一次测定的精密度。通常采用高、中、低三种浓度的同一样品各7～10份，每种浓度的样品按所拟定的分析方法操作，一次开机后，一一测定。计算每种浓度样品的SD值及RSD值。批内精密度也可视为日内精密度（with－in－day precisiｏn）。
　　所得RSD应争取达到5％以内［17－181，但不能超过10％。
　　批间精密度（between-run precision）：是不同次测定的精密度。通常采用高、中、低三种浓度的同一样品，每种浓度配制7～10份，置冰箱冷冻。自配制样品之日开始，按所拟定的分析方法操作，每天取出一份测定，计算每种浓度样品的SD值及RSD值。批间精密度也可视为日间精密度（day to day precision）。
所得RSD应控制在15％以内。
二、准确度
准确度（Ａccuracy）是指测得结果与真实值接近的程度，表示分析方法测量的正确性。由于“其实值”无法准确知道，因此，通常采用回收率试验来裴示。生物药物分析中，常用标准添加法来计算回收率，即取已准确测定药物含量P（present）的真实样品（如人血浆样
品等），再加入药物标准品已知量A（added），混合物作为测定液，其测定值为M（meａｓuｒed）。测定液要配制成高、中、低三种浓度，每个浓度测定3～5次，求出每种浓度的平均测定值Ｍ，且RSD应符合要求。由于预先要准确测定样品中原含有的药物量P，因此也应测定3～5次，求其平均值Ｐ，且RSD应符合要求。
　　按上式计算出的回收率，其结果越接近100％表明分析方法准确度越高。生物样品分析时，一般控制回收率范围应为85％～115％（样品药浓≥200μg／L〉及80％～120％（样品药浓<200μg／L）。
　　制剂的含量测定时，采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法作回收试验及计算RSD，还应作单独辅料的空白测定。每份均应自配制模拟制剂开始，要求至少测定高、中、低三个浓度，每个浓度测定三次，共提供9个数据进行评价。回收率的RSD一般应为2％以内［18］。
三、检测限
检测限（limit of detection, LOD）是指分析方法能够从背景信号中区分出药物时，所需样品中．药物的最低浓度,无需定量测定.LOD是一种限度检验效能指标，它既反映方法与仪器的灵敏度和噪音的大小，也表明样品经处理后空白（本底）值的高低。要根据采用的方法来确定检测限。当用仪器分析方法时，可用已知浓度的样品与空白试验对照，记录测得的被测药物信号强度S与噪音（或背景信号）强度N，以能达到S／N＝2或S／N=3时的样品最低药浓为LOD；也可通过多次空白试验，求得其背景响应的标准差，将三倍空白标准差（即38空或3S空）作为检测限的估计值口。为使计算得到的LOD值与实际测得的LOD值一致，可应用校正系数（ｆ）来校正，然后依之制备相应检测限浓度的样品，反复测试来确定ωD。如荧光光谱法测定时，检测限＝f·38f，根据此式计算出的LOD，再通过制备相应检测限浓度的标准品溶液的测定，以验证实际测得的LOD与上式计算结果相符。如用非仪器分析方法时，即通过已知浓度的样品分析来确定可检出的最低水平作为检测限。
四、定量限
　　定量限（limit of quantitation, LOQ）是指在保证具有一定可靠性（一定准确度和精密度）的前提下，分析方法能够测定出的样品中药物的最低浓度。它反映了分析方法测定低药物浓度样品时具有的可靠性。它与上述的检测限的差别在于定量限要定量测定某一药物在样品介质中的最低浓度，且定量限规定的最低浓度应该符合一定的精密度和准
确度的要求。确定定量限的方法也因所用方法不同而异。当用非仪器分析方法时，与上述检测限的确定方法相同；如用仪器分析方法时，则往往将多次空白试验测得的背景响应的标准差（即空白标准差）乘以10，作为定量限的估计值，继之，再通过分析适当数量已知接近定量限或以定量限制备的样品来验证。
五、选择性
　　选择性（selectivity）是指在样品介质中有其他组分共存时该分析方法对供试物质准确而专属的测定能力。它与专属性（specificity）的含义稍有不同。
　　专属性是指一种方法仅对一种分析成分产生唯一信号：选择性则可对多种化学成分产生不同响应，而主要成分的响应可与其它响应区分。
　　因此，选择性是指该法用于复杂样品分析时相互干扰程度的量度。
　　在药物分析中，考察一个分析方法的选择性时，应着重考虑杂质、降解产物、相关化合物以及制剂辅料等其他组分是否对被测药物的测定有干扰。一般，通过添加上述物质的样品与未曾添加的样品所得分析结果进行比较而确定。
　　在生物药物分析时，考察一个方法的选择性应着重考虑：
　　（1）内源性物质的干扰：可取空白样品（如空白血浆）试验。色谱分析时，要求药物和内标峰附近无干扰峰；光谱分析时，要求药物的测定波长处应无杂质吸收或荧光。
　　（2）代谢产物是否会干扰原药的测定响应值，可用给药数次后病人的尿液（含代谢物）来进行试验［2］。若药物在体内代谢情况为已知，且可获得代谢物标准品，则可将其加入空白样品以及加入实际样品中，验证是否有干扰。
（3）在临床药物监测时要考虑同时服用药物的干扰。将同时服用的药物加入空白样品中以及加入含药物的实际祥品中J观察得到的色谱图和比较测定结果，判断是否对药物测定有干扰。色谱分析除可用色谱图表明同时服用药物不干扰外，还可以分别列出这些药物的保留时间，显示有无干扰。
六、线性与范围
　　分析方法的线性是在给定范围内获取与样品中供试物法度成主比试验结果的能力。换句话说，就是供试物浓度的变化与试验结果（或测得的响应倍号：成线性关系。
　　所谓线性范围是指利用一种方法取得精密度、准确度均符合要求的试验结果，而正成线性的供试物浓壁的变化范围，其最大量与最小量之间的间隔，可用mg／L～mg／Ｌ，μg ／ml～μg／ml等表示。
　　线性与范围（linearity and range）的确定可用作图法（响应值Y／浓度x）或计算回归方程（Y＝a＋bX）来研究建立。
测定样品时所有生物药物分析方法都必须同时作标准曲线。每次作标准曲线时，方法应与分析方法考核时完全一致。标准浓度应包括一定梯度的5～8个浓度（非线性者如免疫分析可适当增加），每个浓度只需测定一次（免疫分析可测定两次并取均值）；标准曲线应覆盖样品可能的浓度范围，对于含量测定要求一般浓度上限为样品最高浓度的120％，下限为样品最低浓度的80％（但应高于LOQ）；目前仍广泛采用相关系数（r）表示标准曲线的线性度，并控制ｒ≥０.９９００。对照品的LOQ必须包括在线性范围内。
七、重现性
分析方法的重现性（ruggedness）是指利用相同的方法在各种正常实验条件下对同一样品进行分析所得结果的重现程度。所谓各种正常实验条件，包括不同的实验室、不同的分析人员、不同的仪器、不同批号的试剂、不同的测试耗用时间、不同的分析温度、不同的测定日期等等。分析方法重现性的测定是通过在不同实验室由不同的实验者（操作和环境条件虽有差别但仍在规定的分析参数内）对同一样品的分别测试而获得的。重现性即是指在不同实验室中使用此种分析方法的精密度。
八、耐用性
分析方法的耐用性（robustness）是评价其保持不受参数微小变差影响的能力，并可作为正常使用的一个可靠性指标。
九、与参比方法测得结果的相关程度的比较
由于生物样品中含有许多干扰测定的杂质，特别是与原型药物相似的代谢物常对药物的测定有影响。因此，除考察选择性外，有时还用参比方法对实际生物样品同时测定并进行比较。比较试验时，取若干份实际样品（如病人服药后采取的血样），用一个已证明有相当专属性和可靠性的方法与新建立的方法同时进行测定，以参比方法测得的药浓为横坐标（Ｘ），以新建立方法测得的药浓为纵坐标（Ｙ）作成散布图（scatter diagram）,并求出直线回归方程（ｙ＝ａ+ｂｘ）及相关系数（ｒ）
ｒ最大值为1，表示两法完全相关（结果完全吻合）；r＝0时，表示两法完全不相关。一般要求两法的相关系数r≥0.95，而相关直线的斜率（b）应接近于1。
下面以HPLC法测定血清中链霉素浓度为例
新方法测定血清中链霉素，是在碱性条件下与茚三酮柱后衍生产生荧光，用离子对－HPLC法、荧光检测器检测；并用荧光偏振免疫测定法（fluorescence polarization immunoassay, FPIA）作为参比方法对照，结果表明两法相关性良好，如图3－7。
评价一种分析方法的效能，并不一定对上述各项指标都有要求。一般，根据方法的使用对象有所区别。大体上有以下四种情况：
1.用于原料药中主要组分或制剂中有效组分含量测定的方法：除了检测限和定量限二项指标外，对精密度、准确度、选择性、线性与范围、耐用性等均应有所要求；
２.用于原料药中杂质测定或制剂中降解产物测定的方法又可分为两种：①用于含量测定：②用于限度检查。
对于①法的要求是：除检测限和精密度指标不必要求外，对准确度、选择性、线性与范围、定量限、耐用性等均应有所要求；
对于②法的要求是：只对检测限、选择性和耐用性三项指标有所要求，其余均无需要求。
3.用于溶出度测定的方法及药物释放度测定的方法，只有精密度和耐用性有所要求，其余项目均不作要求。
４.用于生物样品中药物测定的方法，对精密度、准确度、检测限、选择性、可测线形范围、定量限、对生物样品的耐用性以及与参比方法测得结果的相关程度的比较等指标应有所要求。