主题：【分享】手动进样技术活

目前很多制药企业都主要以自动进样为主，只有学校和一些中小型的第一方实验室使用手动进样。小编最早做实验用的就是手动进样，实不相瞒，测盲样儿测得简直要吐血，重复性太差，一遍一遍的测。。。说白了，手动进样考的就是个熟练度，熟能生巧，再加上有经验了自然数据就可信度高，重复性那还叫事儿吗。说起来，除了熟练基本功，还有哪些经验型的东西值得总结呢?

重复性差原因
手动进样导致的面积重复性差原因主要有以下：1、进样量不合适;
2、所用进样针刻度不准;
3、进样针里有起泡;
4、进样口松动，针插不紧;5、进样针太细，插不紧;
6、转子密封垫脏、磨损或漏液;
7、进样方法不正确。可以自己对照逐个排除。1进样量的把握以20ul原配样品环为例，部分注入样品进样体积在5-15ul重现性好，建议10ul。全部注入样品进样体积以20*4，即80ul重现性好，就是要达到样品环体积4倍以上。2手动进样步骤1 吸样后擦针、排气泡;2 进样状态(inject)下插针到底部;3 快速切到装填(load)状态;4 较快匀速推针杆，注入样品;5 快速切回inject;6 拔针。步骤要牢记，速度要把握好，熟练才是最好的。

使用及保养事宜1、手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增。再转到进样位，过高的压力冲击在柱 头上会造成损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。2、注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。平针头的优点：A：针头外侧紧贴密封垫内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气。B：防止针头刺坏密封垫及划伤定子。应该注意选择质量好的液相色谱专用注射器。3、装液量有部分装液法和完全装液法两种。A：部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75%。B：完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍。这样才能完全置换定量环内残留的溶液。4、可根据进样体积的需要选择定量环，一般不要求精确计算定量环的体积。譬如，一根名义上10uL的定量环，实际是9uL还是11uL并不重要，因为被测样品和校正样品的进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。5、样品溶液均要用滤膜过滤。防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。6、每天使用后应冲洗进样器，通常用适当的有机溶剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置 反复冲洗。7、注意擦拭注射器针头的外侧。防止交叉污染。HPLC 手动进样器的清洗
    手动进样阀的清洗，一般来说目的就是为了消除交叉污染或样品的残留产生鬼峰从而造成进样重复性变差等问题。一般来说我们采用的进样方式都为在inj状态下进针，然后转换到load状态进样，然后转换到inj状态，然后拔针。这种进样方式样品的主要残留在自进样口到转子密封这一段。冲洗方式为：采用阀自带的针孔清洁器用不含盐的流动相，在load 和inj 两种状态反复冲洗冲洗目的不是为了冲洗定量环，而是为了冲洗自进样口至转子密封这一段，和废液管。
固定的冲洗可以冲掉进样口粘附的样品及可能的盐，样品残留可能影响第二针的测定结果，盐残留可能磨损定子和转子之间的光滑面。具体先后吸超纯水和色谱纯甲醇冲洗。一般在关闭仪器后再清洗，因为有些六通阀带有触发开关，你在扳动六通阀的时候，梯度程序会自动启动。还有在进一针高浓度的样品后一般要冲洗。gc 手动进样应注意的问题
    犹如医院里的护士打针，有的可让患者在不知不觉中就完成了注射，而有的则会让患者感到痛苦。gc中手动进样技术的熟练与否，也直接影响到分析结果的好坏。好的进样技术的主要要求(针对常规液体样品)是：
(1)注射速度快注射速度慢时会使样品的汽化过程变长，导致样品进入色谱柱的初始谱带变宽。正确的注射方法应当是：取样后，一手持注射器(防止汽化室的高气压将针芯吹出)，另一只手保护针尖(防止插入隔垫时弯曲)，先小心地将注射针头穿过隔垫，随即以最快的速度将注射器插到底，与此同时迅速将样品注射入汽化室(注意不要使针芯弯曲)，然后快速拔出注射器。注射样品所用时间及注射器在汽化室中停留的时间越短越好，且每次注射的过程越重现越好。(2)取样准确而重现即取样量要准确，抽取样品的速度要重现，以保证进样的重现性。特别是黏度大的样品，要避免在注射器中形成气泡。防止产生气泡的办法是将注射器插入样品溶液，多次推拉针芯，推下时要快，拉起时要慢。最后可能会有很小的气泡在针管中，不易除去。这时可以取多于实际进样量的样品(比如，进样量为1μL，可取2-3μL样品)，然后将针尖朝上，用手指轻轻弹击针管，气泡就会跑到液体的上方。再将多余的样品推出针管，气泡也就排出去了。这跟护士打针时避免将空气注射进体内的道理是一样的。要使取样量准确，也是这样倒置注射器，使视线与针管中的液面处于同一水平上。然后推压针芯到所需刻度。至于针尖外面粘附的一部分样品，可用一片滤纸快速擦拭而除去(注意不能让滤纸吸去针管内的样品)，也可不管它，因为它会被进样隔垫擦去(但这会加速隔垫的老化)，而隔垫的问题则由隔垫吹扫来解决。
(3)避免样品之间的相互干扰如果进样时注射器内有上一个样品的残留组分，就会干扰下一个样品的分析，带来定量误差。在色谱中这叫做记忆效应，是必须消除的。具体办法是洗针。取样前先用样品溶剂洗针至少3次(抽满针管的三分之二，再排出)。再用要分析的样品洗针至少3次，然后取样(多次上下抽动)，这样基本上可消除记忆效应。如果同时有几个样品进行分析，且要交替进样(如用外标法分析时，可能对标样和实际样品交替进样)，则最好是每个样品各用一个注射器，既能避免样品之间的相互干扰，又不至于消耗太多的样品(可用的样品量小时，这是要考虑的问题)。(4)选用合适的注射器 gc分析最常用的是10μL微量注射器，其进样量一般不要小于1μL。如果进样量要控制在1μL以下，就应采用5μL或1μL的注射器。此时要注意，5μL或1μL的注射器往往是将样品抽在针尖内，因此观察不到针管中的液面，故很可能抽入气泡。取样时反复推拉针芯，以确保针尖内没有气泡。(5)减少注射歧视所谓注射歧视是指注射针插入gc进样口时，针尖内的溶剂和样品中的易挥发组分首先开始汽化;无论注射速度多快，不同沸点的组分总是有汽化速度的差异。当注射完毕抽出针尖时，注销器中残留样品的组成就与实际样品他组成有所不同。显然，高沸点组分残留的要多一些。换句话说，进入色谱柱的样品中的高沸点组分含量可能低于实际样品，从而造成定量分析的误差。如果能保证每次进样的速度严格一致(如用自动进样器)，经标样校正后，可忽略这一歧视作用。但用手动进样时这是难以达到的。所以必要时应使用热针进样或溶剂冲洗进样技术。前者是指取样前先将注射针插入汽化室预热一定时间，然后再按正常方法进样;后者则是取样前先在注射器中抽入一定量的溶剂，再抽取样。这样在注射样品时，溶剂有可能将样品全部冲洗进入汽化室。相比之下，溶剂冲洗进样的操作较为简单有效，但应注意所用溶剂量太大会造成色谱柱超载。
气相手动进样之技巧
1、进样速度要快。取样后，一手持注射器，另一手保护针尖(防止插入时弯曲)，小心地将针头穿过隔垫，随即以最快的速度将注射器插到底，同时迅速将供试品注射入汽化室，然后快速拔出注射器。2、取样量要准确。3、为避免供试品之间的相互干扰。取样前先用供试品溶剂洗针至少3次(抽满针管的2/3，再排出)，再用要分析的供试品洗针至少3次。4、选用合适的注射器。gc分析最常用的是10μl微量注射器，其进样量一般不要小于1μl。进样量要控制在1μl以下，就应采用5μl或1μl的注射器，由于此类注射器往往是将供试品抽在针尖内，取样时应反复推拉针芯，以确保针尖内没有气泡。5、微量注射器用后必须用甲醇等有机溶剂清洗干净。扎针时感觉进样垫较紧, 则注样后拔针可快;若扎针时感觉进样垫较松, 则注样后拔针可慢点。尖头注射器进样如果遇到有坚硬阻力,切莫拔针;而是将注射器向左或右旋转下继续扎针。尖头注射器如果被硅胶未堵住针尖,则可将针杆拔出,再重新将针杆放入注射器孔内,利用空气的压缩性快速将硅胶未排出针尖;如果还不行,则将针尖扎到高温汽化室内,针尖高温下再排空,一般可用空气挤出针尖硅胶未。 以上二方法还不能见效,则可用酒精灯或打火机烧红你的针尖,再排空。（本文由实验与分析编撰整理）