主题：【讨论】关于USP中的双级溶出检验法

明胶交联作用及溶出度变化的问题 

    以明胶为主的处方出现一个最主要的问题就是在很长时间之后溶出度会有明显的下降，这个问题被归咎于明胶的交联作用。交联作用可以使整个处方变成膨胀的、薄的坚韧而有弹性的水溶性膜，也可以称作薄膜。薄膜作为一层屏障，限制了药物的释放。而且在轻微搅拌下，薄膜也不容易破裂，溶出度值常常会降低到零点（rejection point）。

由于在溶出液中添加胃肠酶（胃蛋白酶或胰液酶）后溶出效果好，因此建议在美国药典中对特定检测含明胶药品的溶出介质中增加酶。这项建议是以酶可以消除高度交联的明胶胶囊外壁对药物分子所形成的阻碍屏障为基础的，溶出液加酶后会降低实验时间和实验成本。

    因此，1993年7月美国药典溶出度及生物利用度分委员会（DBA）建议制定第二实验方法，对按照第一实验方法不符合规定的老化胶囊使用含有酶的介质。同时此项建议也声明胶囊的生物利用度不能因此变化而降低这一条件。1994年年初这项建议被提交到美国药典论坛。几乎同时，FDA的工业明胶胶囊生产组成立，美国药典委员会也是其中参与者之一。因此DBA决定推迟这一建议的正式化，直至生产组完成他们关于生物利用度－生物等效性问题的研究。1997年初，美国药典论坛对按照正式实验方法不合格的硬胶囊推出了双级（two-tier）实验。最初曾建议在每个药物的各论中增加第二实验方法的使用条件。而在1997年九十月间出版的美国药典中，第二溶出实验介质被写入总论<711>"溶出度"中，这一双溶出液实验方法最终出现在美国药典25版上。

双级实验（The two-tier test）

    双级实验包括药物的各论中规定的最初溶出液中不含酶的方法。第二溶出试验是在含有酶的介质中进行的。在不同pH条件下，推荐使用两种酶。各论中规定的水或介质pH＜6.8时推荐使用纯胃蛋白酶，它可以引起≤750000单位／1000ml的活性；而介质pH≥6.8时，在介质中不应加入超过0.05g/1000mL的胰酶。

    将本实验扩大到可溶性药物中  最近人们试图使含可溶性药物的处方其溶出度测定也可以使USP双级实验。为了得到应用目的，人们考虑使用非离子表面活性剂配合胃蛋白酶。

    造成问题的化学过程（The chemistry of the problem）

    Digenis et al.的一篇极好的综述中描述了相关制药环境所造成的明胶交联作用的合理机制（mechanistic rationalizations）。因此本文并没有详细讨论这种机制。

    假定的化学过程  下面三种化学过程被假定涉及相互交联作用。

    l 明胶与三氨基酸赖氨酸的反应性增高。彼此邻近的赖氨酸残基氧化脱氨产生最终的乙醛集团。一部分乙醛集团被相邻的赖氨酸的自由ε－氨基集团攻击产生亚胺，随后经过醛醇浓缩反应产生了含有吡啶环的交联作用的产品。

    a 当杂质中含有乙醛时，赖氨酸的自由ε－氨基集团与乙醛反应。反应产生羟基甲氨酸（hydroxymethylamino）衍生物，然后脱水形成阳离子亚胺。后者与其他羟基甲氨酸（hydroxymethylamino）赖氨酸的残余物质反应形成乙烯醚（dimethylene ether），并最终重排形成彼此以亚甲基联接的两个赖氨酸自由ε－氨基集团，导致随后的交联作用。

    b 明胶交联作用的第三种形式是自由氨基集团与阳离子亚胺中间体（见前面黑体字）反应产生的氨化形式和乙缩醛的胺形式。这种类型的反应中外界的pH值发挥着很大的作用。

    c 葡萄糖或药物配方中常用的其它醛糖会发生与之类似的反应。这些糖类的醛基与游离氨基集团反应，形成亚胺，并且通过重排产生酮糖。随后酮糖的羰基集团与另一个胺反应，形成交联明胶。 

    不仅仅有赖氨酸-赖氨酸交联，赖氨酸-精氨酸交联和精氨酸-精氨酸交联也有报道。总而言之，明胶多肽的交联能够以以下两种方式进行：

    a 同一多肽链内部发生架桥（链内，分子内交联）

    b 两个相邻肽链上的氨基酸可桥联（链间，分子间交联），这一过程增加了明胶的分子量。
交联导致在最初分子间排列紧密时形成的粒子间键脱去，代之以新键形成，最终形成了一种具有不同的多孔性和多孔结构的剂型，因此体外释放模式也会与原来不同。

    导致交联的几个原因

    人们发现：一些化学物质，高湿，高温和光照对于外层含明胶的配方的体外溶出时间延长起到了单独或协同影响。本节将讨论一些已有报道的例子。

    化学物质：

    普遍知道的可引起明胶变性的化学物质中，甲醛研究的最为深入。在剂型中，它从增塑剂、防腐剂、脂肪和聚乙烯化合物中释放出来，如PEG、PEG和脂肪醇或苯酚形成的酯，聚乙烯甘油酯（polyehtylenated glyceride）非离子型表面活性剂（聚山梨酸酯，不饱和脂肪酸酯）以及含六亚甲基四胺为稳定剂的玉米淀粉。为了在甲醛浓度和含明胶制剂的溶出度降低程度之间寻找相互关系已经做了大量工作。相反，人们已利用明胶与甲醛的交联反应生产肠溶胶囊。

    也已知道色素，特别是FD&C 3号红和FD&C 40号红在明胶结构特性的变化及导致其溶解性降低方面起到了重要作用。色素与明胶通过疏水键合或氢键键合的方式相互作用。Murthy 等人发现当含有FD&C 3号红的胶囊在高湿和光照下贮藏时，其溶出度明显下降。

    Ray-Johnson and Jachson报道了明胶与碳酸钙和其它水不溶性化合物如硫酸钙、碳酸镁的反应。但是，对于水溶性盐类（如氯化钙和氯化镁）没有发现有不良作用。因此，推断在不溶性钙盐存在时明胶性质的变化是由于片剂包衣内部的物理变化导致，而不是离子和明胶间的化学反应导致。

    另外的两项研究报道了填充在装有胶囊的高密度聚乙烯瓶口处的人造丝线圈也会对胶囊的溶出度产生负面影响。人造丝产生糠醛，当其以饱和气体存在时会很快降低胶囊的溶解性。

    Hartauer等人报道了在2个月和3个月的加速环境条件下贮藏，含人造丝线圈的包装中装有的少量胶囊（10个）的溶出度显著下降。

感谢分享，我明白了为什么USP做软胶囊要用两种方法，我原以为一种就可以了