主题：【资料】GST蛋白纯化过程中的常见问题及解决方案

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发表于：2023/10/30 17:10:31 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

在生物科学领域，蛋白质纯化是一项关键的技术，它对于研究生物分子的结构和功能至关重要。谷胱甘肽S-转移酶（GST）是一种在许多生物体中发现的蛋白质，它参与了多种生物学过程，包括解毒和细胞保护。在实验室中，我们常常使用GST来纯化目标蛋白。然而，在这个过程中，可能会遇到一些常见问题。本文将探讨这些问题，并提出相应的解决方案。

一、目的蛋白结合效率低或不结合

①裂解方式：过分的裂解会使标签蛋白变性，阻止其结合

建议：在裂解过程中调节合适的超声功率和间隔时间或采用温和的机械/化学裂解方法。

②缓冲液条件：谷胱甘肽-琼脂糖树脂在pH值低于6.5或高于8.0时，结合效率会降低

建议：使用前需用pH为6.5~8.0的PBS进行平衡。

③蛋白发生变性或聚集

建议：使用前需用pH为6.5~8.0的PBS进行平衡。

建议：可在裂解前加入1-10mM的DTT，在缓冲液中也加入DTT；蛋白-核酸结合或蛋白-蛋白结合可加氯化钠。

④蛋白或脂类在介质中聚集

建议：及时清洗介质或更换新的介质。

⑤上样过程：上样量过载与上样流速过高均会影响GST标签蛋白的结合

建议：在上样过程中要注意控制上样量与保持低流速。

⑥GST 融合蛋白发生聚集沉淀

建议：在裂解Buffer和其他缓冲体系中加入DTT

⑦GST融合蛋白被过度稀释

建议：重新浓缩样品，增加蛋白浓度。

二、目的蛋白洗脱不下来或洗脱率低

①洗脱条件

建议：可以通过加大洗脱液体积、降低流速以及延长洗脱液的保留时间等措施提高洗脱效率。

②样品没有经过前处理

建议：样品上柱前必须要经过离心或过滤。

③非特异性吸附

建议：适当选择添加剂降低非特异性吸附。

④洗脱缓冲液中谷胱甘肽被氧化

建议：洗脱缓冲液需现配现用，另外可以尝试加入1-5mM的DTT。

⑤洗脱蛋白有杂质

GST融合蛋白被蛋白酶部分降解

建议：加入蛋白酶抑制剂PMSF。注：丝氨酸蛋白酶抑制剂必须在使用凝血酶或凝血因子Xa 前除去。

⑥GST融合蛋白被蛋白酶部分降解

建议：使用蛋白酶缺陷型菌株lon-或ompT，或ompT和lon双缺陷型菌株。

更多详情可以关注：GST标签蛋白纯化https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/gst-tag-protein-expression