主题:【资料】深入了解GST标签:作用机理、优势与劣势以及常见问题解析

浏览0 回复0 电梯直达
Ins_bf0c01c3
结帖率:
100%
关注:0 |粉丝:0
新手级: 新兵
胱甘肽S-转移酶(GST)是由多基因编码、具有多种功能的超家族酶,GST广泛存在于细菌、真菌、动物和植物体内的一种解毒系统中,其专一性催化还原型的谷胱甘肽巯基与其他化合物的亲电基团,生成谷胱甘肽衍生物,具有降低化学反应活性的效应。在各种生物体内,GSTs是由多个基因编码的、具有多种功能的一组同工酶,分子量为2329kDa,由200240个氨基酸组成。有膜结合和胞液两种形式,以胞液GSTs为主。根据蛋白酶的一级序列、免疫原性、酶动力学和三、四级结构的性质,GST又可以分为多个亚类。



GST标签作用机理



1)应用于原核表达,作为一种高度可溶的蛋白,能增加外源蛋白的可溶性,在大肠杆菌中大量表达,起到提高表达量的作用;



2GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱,因此保留了蛋白的抗原性和生物活性;



3GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力,因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂(如:盐酸胍或尿素等);



4GST融合蛋白已经成为分子生物学领域的基本工具,其广泛用于研究蛋白质-DNA及蛋白质-蛋白质间的相互作用,也可作为抗原用于免疫学或疫苗的研究。



5GST标签的切除:①凝血酶:一种应用很广泛的蛋白酶,主要特点是经凝血酶切割后的重组蛋白在切割位点的C端会保留两个氨基酸残基。凝血酶可以识别两种类型的氨基酸序列,分别为X4-X3-P-P[K]-X1?-X2?和X2-R[K]-X1?,凝血酶对前一种序列的识别效果更为理想。②Xa因子:Xa因子是一种较高效的去除融合标签的工具酶,可特异性识别I-E[D]-G-R-X1序列,并将融合标签从其C末端切除。





GST标签纯化蛋白的优劣势:

优势:

1. 适用范围广,可在不同宿主中表达;

2. 增强外源蛋白可溶性;

3. 可用不同的蛋白酶进行去除;

4.  有助于保持蛋白的抗原性与生物活性,提高外源蛋白的稳定性;

5.  特异性好,纯化方便且温和。



劣势:

1.  分子量较大,可能会影响蛋白质的功能和下游实验;

2.  仅能纯化可溶性蛋白,若蛋白不可溶,则很难用变性的方法纯化。



GST标签纯化蛋白常见问题解析:



问题一:GST 融合蛋白的产量低或无法检测到

1、原因:融合蛋白形成包涵体

解决方案:

①采用低温(1625℃)培养细胞,或者诱导过程中降低诱导剂的终浓度至1mM,或者缩短诱导时间。

②纯化前需要完全融解和复性。将裂解液与GST标签蛋白纯化琼脂糖凝胶在摇床上轻摇2个小时或者更长时间(过夜),充分结合后上柱纯化。



2、原因:融合蛋白可能失活

解决方案:采用温和的超声破碎条件或者其他的裂解条件,比如采用溶菌酶。



3、原因:融合蛋白被蛋白酶降解

解决方案:在裂解步骤或洗涤步骤加入适量的蛋白酶抑制剂,如PMSF



4、原因:融合蛋白不能有效地从树脂上洗脱下来

解决方案:

①延长洗脱时间,或者增加洗脱液中还原性谷胱甘肽的浓度至15mM或者更高调节洗脱液的pH值至8.09.0

②在洗脱液中加入Triton X-100(终浓度0.1%)、辛基-葡萄糖苷(终浓度2%)或者NaCl(终浓度0.10.2 M)。



问题二:洗脱液中有较多杂带

1、原因:融合蛋白被蛋白酶降解

解决方案:在裂解步骤或洗涤步骤加入适量的蛋白酶抑制剂如PMSF



2、原因:一些宿主蛋白,比如伴侣蛋白,可能会和融合蛋白互相作用

解决方案:

在洗涤液中加入DTT(终浓度5 mM)。在纯化前将重组蛋白溶液和伴侣蛋白溶液(2 mM ATP, 10mM MgSO4, 50 mM  Tris-HCl)37℃振荡10 min



3、原因:过度的超声处理会导致一些蛋白与融合蛋白相结合

解决方案:采用温和的超声破碎条件或者其他的裂解条件。



4、原因:有些蛋白会与融合蛋白或树脂发生非特异性结合

解决方案:优化洗涤条件:加入一些洗涤剂如1%  Triton X-1001%Tween-200.03%  SDS 或者0.1% NP-40 可以降低非特异性吸附。优化洗涤液中的盐浓度也可以降低非特异性吸附。



更多GST标签蛋白纯化详情可以关注义翘神州:https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/gst-tag-protein-expression
为您推荐
您可能想找: 技术咨询 询底价
专属顾问快速对接
立即提交
猜你喜欢 最新推荐 热门推荐
品牌合作伙伴