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发表于：2010/10/10 07:59:10 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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《对LC的认识》我写了一些，大家看了有什么疑问尽量提出来，我会在第一时间跟大家交流，力争办这个活动办成讲座性质的。
对LC的认识(1)
对LC的认识（2）
对LC的认识（3）
对LC的认识（4）
对LC的认识（5）
对LC的认识（6）
对LC的认识(7)
对LC的认识（8）
对LC的认识（9）
对LC的认识（10）
对LC的认识（11）

对LC的认识(13)----缓冲盐的作用及亲水性C18柱
对LC的认识（14）
现将所有的内容整理贴出，方便大家的阅读

LC认识一：

看到大家都比较喜欢在论坛上分享自己的经验，我这个平常只浏览帖子的人也忍不住想写写东西，但又害怕水平有限，望大家多多包含。
分析给我最大的认识是：必须得有自己的想法，必须会动脑，否则你做起实验来仅仅是个操作机器人（这点最重要）。好了，下面直接说我的认识：
首先，要用LC测定一个物质，首先得对这个物质的物理、化学性质有个清醒的认识。像溶解度，PKA值，物质的官能团都是需要了解的。这里不说像蛋白质，氨基酸等等这些大分子的分析方法，因为它们有专门的分析柱分析。我想说的是对于一般的有机物的分析，因为它们大多数是可以用C18分离的。这些物质无外乎就是有机酸或者有机碱，记住很重要的一点，有机酸分析时加酸抑制电离；有机碱根据极性和疏水性来判断是加酸还是加碱，如果它的极性大，在柱子上难保留，那就需要加酸，目的是让目标物结合质子，和离子对试剂形成缔合物在柱子上保留，在这里我强烈推荐三氯乙酸或者三氟乙酸，我认为它们不仅起到酸的作用，而且起到了部分离子对试剂的作用。如果它的极性小，很容易在柱子上保留，并且可能会有次级保留，那么一般是需要加点扫尾剂三乙胺的。
其次，关于洗脱程序的设定。等度没什么好说的，我想强调下保留时间。一般洗脱是要保证目标物的保留因子K在0.5-20的范围内，所以保留时间不能太长，超过了60min说明你这个洗脱程序是失败的（针对分析而言）。梯度洗脱就要好好理解了，因为组成复杂的样品一般都要用到，记住梯度洗脱时最重要的一点：开始的梯度设置的尽量缓一些，目的是为了使那些保留因子小的组分能够很平稳的洗脱出来，得到比较好的峰型与分离度，后面的梯度可以尽量设置的陡一些，目的是使那些保留因子大的组分能够较快的出峰，当然要兼顾分离度，因为如果太迟出峰的话会使得峰型很差，柱效下降，灵敏度变差。这是因为保留时间太长，导致组分在柱子中展宽的机会增多，使得峰展宽严重。我个人的经验是等度梯度混合使用比较好，一般保留比较弱的组分设置等度就能分离得比较好，要想设置一个有效的梯度，“三倍规则”和“用等度还是梯度判断原则”还是要好好了解下。
第三，一些LC分析的经验。如果用紫外检测器检测话，目标的摩尔吸光系数大于5000响应会比较好，用缓冲盐磷酸盐是个不错的选择，因为它紫外背景吸收小，达到同样PH值所需要的量少（相比醋酸而言），另外还要注意流动相溶剂的截止波长，总之有很多经验可言，我就不一一细说了。

二

作为LC的版主，我有责任跟大家分享一些我对LC这方面的理解，范围比较广和杂，加上本人水平有限，望大家多多包涵。
今天我想说的是关于标准曲线和工作曲线的问题，通俗的说，标准曲线就是不考虑样品基质效应，而直接用纯标准品配置不同浓度而得到的一条线性回归曲线，这对于一些基质简单的样品是完全可以的。但如果样品的基质比较复杂时，你仍然按照这种方法做，那么误差会相当大，并且加标回收率会相当低。这时我们就要考虑用工作曲线了，简单的说：工作曲线就是带基质效应的标准曲线，因为这种情况下的样品往往需要经过一系列的前处理，所以我们往标准品中加样品的基质，再将配置好一系列浓度的标准品和样品按照相同的前处理步骤处理后，再经LC测定便得到了工作曲线，这就是带基质效应的标准曲线，用它来测定实际样品的浓度会比较准确，可信；并且也能得到较高的加标回收率，希望大家在做实验时不要忽视这一点。
有人说做工作曲线的步骤跟测加标回收率的步骤是一样的，实际上它们仍有些不同。加标回收率分为实际样品的加标回收率和方法的加标回收率，这两者的区别就是一个本身含有目标组分而另个本身不含有目标组分；如果样品含有目标组分，要确定它的浓度，可以用工作曲线测定（外标法），也可以用标准加入法。

三

今天我要给大家讲的是LC一些使用技巧的方面，都是个人的理解，望大家指正。
第一点：在进行梯度洗脱时，第一针先进溶剂预平衡下色谱柱，这样做的目的是：可以判断是否因为梯度而引起一些杂峰，而且可以扣除背景吸收，并且可以在所设定的梯度体系下活化柱子，可谓有很多好处。
第二点：对于一个未知样品，如果用反相色谱分析，首先用纯有机相确定目标组分的保留性，再根据“三倍规则”调整，以得到满意的分离度和分离效果。
第三点：很多人都只知道得到的色谱峰越尖锐、峰高越高越好，但为什么这样好却不怎么理解。这是因为：峰越尖锐，峰高越高说明柱效越高；事实上峰尖锐和峰展宽两种情况下峰面积是一样大的，只不过是峰越尖锐使得峰面积积分越准确，灵敏；受阈值的影响小。
第四点：判断色谱峰是否纯的话可以根据纯度因子来判断，我知道Agilent有纯度因子的显示窗口，纯度因子最大值为1000，纯度因子小于900说明肯定不纯，纯度因子越接近1000说明可能越纯。
第五点：关于加标回收率，分为实际样品加标回收率和方法的加标回收率，这个在认识（2）中我已经阐述过，关于加标浓度，一般为样品浓度的0.5-2倍。
第六点：对于为什么缓冲液选择磷酸的解释，相比其它酸，一般选择磷酸效果会更好。这是因为，磷酸的紫外背景吸收最小，而且达到相同的PH值所需磷酸的量最少。
第七点：关于过滤白头何时需要更换，打开purge阀，脱气时发现压力超过10bar的话，说明过滤的白头该更换了，再就是LC最大的问题是压力的升高，这里一定要先判断是否是柱子导致的，因为系统的压力主要是由柱子贡献的，用分段排除的方法排除故障是个很好的办法。
第八点：配置缓冲液的时候，一次尽量配得多一点，因为重复配置总会有差异的，所以对保留时间总是会有一定的影响，这个我曾经验证过。
第九点：关于保留时间提前或者推后的问题（反相），保留时间提前如果不是流动相的问题，最有可能是就是样品太脏的缘故；因为样品脏导致里面的杂质占据了硅羟基的结合位点，使得目标组分在柱子上的结合变得更弱了。保留时间推后最有可能是有机相挥发的缘故。事实上色谱峰重现性不好的一个原因大家都知道：有可能是柱平衡时间不够的缘故。
由于经验太多，一时也不知从何说起，先谈一些，以后慢慢写了给大家指正。

四

看了论坛上大家写了不少原创性的文章，都是自己在实际工作中的经验，这对我们大家来说都是很宝贵的财富，不过我觉得这些文章中存在着一些问题，想跟大家探讨下，希望大家指正。
首先：关于精密度测定的问题。很多人都是取某一个样品连续进5针，算出RSD,这本是没错，但把它写在文章中就不合理了，因为这么做仅仅是对仪器本身的精密度作了考察，不能反映样品的任何问题。即使要写在论文中，那么应该这样做，配置5份平行样品，进样分析算RSD，这对于样品来说才是有意义的。
其次：关于加标回收率的测定。加标浓度的选择不是随意的，一般加标浓度是实际样品浓度的0.5-2倍，这个大家要注意，加标低浓度和高浓度都要做，因为这反映了不同的问题。一个是看低浓度时样品损失如何，准确度如何；一个是针对高浓度而言。
第三：关于论坛上争论比较大的“反冲或者不反冲的问题”。这个按照我做实验的实际情况是：反冲柱子确实会损失一部分柱效，但不是很明显，反冲最大的问题是：即使反冲成功了柱子仍然是用不了多久，这样即使再怎么反冲柱子还是会报废，但反冲确实不失为解决柱压问题的方法。
第四：关于大家讨论关于做色谱质谱“理论还是实践？”的问题；我个人认为，通过做了这么久的LC-MS，一些基本的操作，维护仪器我大体上了解了，实践是很重要，但也绝不能忽视理论知识的学习。如果你只满足于操作、做出结果，而不去思考问题，那么跟个操作机器人没什么两样。说实话像现在的仪器越来越傻瓜化了。举个很简单的例子，谁敢说自己把“梯度洗脱、流动相的优化”完全吃透了？恐怕大多数人还是比较模糊吧。有时我们看到一个实验手段、方法，就要去质疑它，看看能不能找到更好的解决手段。所以思维、创新才最重要。

五

今天继续跟大家探讨我对LC一些肤浅的认识：
首先在使用流动相时，我们得对它的截止波长有所了解。有版友谈到在用醋酸做流动相时基线比较难走平稳，这就是因为醋酸的截止波长在240nm左右，在靠近它的区域内有很多杂质都有比较强的紫外吸收，导致在走基线时比较难于平稳，所以用到每一种物质时必须设置到截止波长以外。
在用LC进行定性、定量时，我们对目标组分的性质要有所了解。比如结构式，通过它的结构式我们可以初步判定它以何种保留机制得于保留，这样对我们选择流动相会有比较大的帮助；举个例子，如果目标组分的结构式含有较多的苯环，对称性也比较好，或者碳链较长，那么它在反相柱上的保留应该比较强，因为仅仅通过纯粹反相保留机制（疏水效应）就能得到较强的保留，所以流动相用有机相和水就行。再比如目标组分是多羟基，多羧基物质，那么可以判定，目标物质的极性比较强，在反相柱上的保留时间比较短，所以需要加缓冲盐，并且将PH值调节至酸性，这样既可以得到比较好峰型，又可以防止拖尾现象的发生。再比如目标物质含N原子比较多，那么我们就按有机碱来分析它，就可以得到满意的结果。
除了对方法的研发要比较熟悉外，对于LC的基本维护我们也要很了解；举几个例子，（1）系统压力高的问题；这需要我们一部分一部分排查，一般最有可能是柱子脏或单向阀堵塞的问题；（2）肩峰、裂缝、平头峰或三角峰的问题；肩峰、裂缝最有可能是柱子脏或者固定相塌陷或者溶剂强度大于流动相强度的问题，而平头峰和三角峰则最有可能是进样量过大的问题；（3）基线难于平稳或产生漂移的问题；这种现象的发生最有可能是柱子脏了，导致不断的又杂质被洗脱出来的缘故，使得背景吸收高、噪音大导致基线不平稳或者产生漂移。
关于LC有太多的东西可说，我会将我掌握的东西都和大家讨论，望指正，谢谢。

六

今天跟继续大家讨论LC的一些问题。
首先谈一下关于定性的问题。有很多版友提到单单依据一个保留时间来定性不准确，这确实是LC的一个弱点，但我们可以通过一些手段来克服这个问题，比如我们可以通过双柱定性（这个用的不多）；还可以通过“用已知物增加峰高法”定性，即向样品中加入标准物，再和样品的峰进行对比，以确认是否含有这种物质，这种方法用的比较多。保留时间的差异一般不能超过0.2min，超过了这个值说明肯定不是一个物质；此外我们还可以通过改变流动相，比较样品和标准物的出峰位置，这也可以作为我们判断的依据。
其次谈一下关于保留时间不稳定，峰面积变化大的问题。保留时间不稳定的影响因素很多，我认为主要可以从下面这几个方面考虑，（1）是柱子平衡时间是否足够；（2）是样品是否相对“干净”，如果样品脏的话，保留时间一般是会提前的，这个我在前面阐述过；（3）进样量是否过大，这个大家一般认为只会影响峰型，但它也会影响保留时间，我做实验曾经出现过这个问题，我判断是由于进样量过大，导致柱吸附饱和，使得一部分样品出峰提前，进而影响了保留时间（这里需要大家讨论）。这三点只是针对一次实验而言，如果两次实验发现保留时间差异大，那最大可能是流动相带来的差异，这个不是问题，我们只要保证一次实验在一个体系、实验条件下差异小就行。关于峰面积变化大的问题，如果是手动进样器，自然是进样误差带来的，如果重复几针RSD在2%左右，是可以接受的，个人认为最重要的是要能把目标组分洗脱下来，不能有残余的组分未洗脱在同一体系、条件下进样分析，峰面积不是问题，因为最后都将峰面积折换成浓度了。
以上是我对版友关心的问题谈下我肤浅的认识，望大家指正。

七

今天继续跟大家谈LC的认识；
首先关于缓冲盐。我们一般用的也就是磷酸盐，甲酸盐，醋酸盐等等，就我而言，用甲酸盐和醋酸盐是比较多的，因为我一般做LC-MS，必须是可挥发性的盐。事实上磷酸盐在LC用的是比较多的，因为磷酸的紫外吸收小，使得背景干扰小；而且达到相同PH值所用的量少。关于使用缓冲盐的好处，大家都知道的是改善峰型，至于为什么能改善深究的人可能不多。这是因为缓冲盐离子会和硅羟基发生作用，也就是说会影响目标组分和硅羟基的作用，进而影响组分和固定相的作用，对改善峰型产生影响，再者缓冲盐离子的极性相比分子肯定大很多，这样也调节了流动相的极性，对出峰情况也造成影响，事实上缓冲盐能改善拖尾的道理也在于此，因为缓冲盐离子和硅羟基的预先作用使得次级保留的影响大大降低，进而改善了峰拖尾。
其次谈一下怎么得到漂亮的峰型。当你在做LC时发现出峰异常时，首先一些最基本的应该考虑到：样品是否变质？浓度是否太大？进样量是否太大？梯度洗脱成程序是否合理？（关于程序怎么设置在前面的认识我已阐述，其实质也就是说：洗脱程序不合理使得灵敏度变得很差）溶剂的强度是否大于流动相强度？如果这些最基本的排除了，再考虑其他因素：是否是柱子脏了的原因？柱子是否塌陷？流动相及流动相的PH值是否合理？这些问题的解决在我前面的认识都详细谈到过，这时就不在累赘。关于怎么样再生柱子，我的方法是先用纯甲醇低流速冲洗，再用甲醇水梯度冲洗，再用异丙醇低流速冲洗，一般能得到比较好的效果，反冲是万不得已的方法。
说来说去LC就这些部分，大家在平常的实验中按照这几点去做去想，一般是没有解决不了的问题的，因为实践过后的认识才是最深刻的，所以我的认识中尽量避免的理论的阐述，望大家指正。

八

今天继续对版友关心的问题谈我的认识。
首先有版友提到提到关于怎么样防止柱子脏的问题，这是个仁者见仁、智者见者的问题。总体上说要保证分析的样品足够“干净”，也就是在前处理上下功夫，有很多基本的手段，像离心、固相萃取、过0.22微米膜等等。我有个不确切的认识，一般我都是保证样品几乎没什么颜色才进样的，因为有颜色的目标组分它们的紫外吸收一般都较强，所以浓度可以在浓度尽可能低下进样分析。样品的进样浓度肯定不能大，一般在紫外检测器检测，有几十个毫吸光度的响应就足够了，记住样品浓度大肯定带来的杂质组分相应就多；还有一个方面柱子最好定期的维护，一般用小流速的甲醇冲洗，也可以用10%的异丙醇不接检测器冲洗，关于为什么要用异丙醇我解释下：一方面是因为异丙醇的洗脱能力较强，可以把柱子内的杂质尽可能排除，另一方面是异丙醇可以增大样品的溶解性和提高溶剂的兼容性，像异丙醇，四氢呋喃等等都有这个作用。最后再设置个梯度用过甲醇和水冲洗柱子。
有版友还提到过怎么才能增加对色谱柱的认识。实际上认识色谱柱并不难，一般我们接触最多的也就是反相柱，搞清楚一点，反相柱填料硅胶用的最多，通过硅胶上游离的硅羟基和硅烷试剂的作用可以在硅胶上键合不同的官能团。如果官能团的是非极性的或者弱极性的，那么就是反相柱。像C18柱，苯基柱，等等，如果官能团是极性的就是正相柱，像氰基柱，氨基柱，硝基柱，等等。我个人认为弄清楚最基本的几种柱子就行了，比如氨基柱，比如hilic柱子，它们的共同点都是可以反相使用的正相柱，它们使用的流动相、使用的注意事项等等弄清楚就行了。
大家在柱子上面有什么疑问提出来共同讨论，谢谢。

九

针对大家比较关心LC保留时间的问题，我在前面有谈到过，可能不怎么详细，今天我们详细的来解决这个问题。
首先关于保留时间偏移的问题。出现这个问题的原因有很多种；大家都能想到是流动相的问题、柱子脏或者固定相坍塌的问题，平衡时间不够的问题。在这里我主要想强调的是“目标组分在分离时的存在形式问题”，因为在某种流动相下，如果目标组分不是以单一的形式存在，那么肯定不仅得不到好的峰型，并且保留时间也是难于重现的。我想给大家说的是：影响目标物的存在形式主要是PH值，那么你如果分离的是酸性样品，一般就把缓冲液的PH值调到3，这样一般是可以让组分以一种形式存在的，就能避免PH值所带来的问题（这是我做LC的经验，因为我也是不喜欢一套一套理论，但有了实验现象后，我会对理论深究的）；如果分离的是碱性化合物，这个要参照它在柱子上的保留时间来看的，我做了很多的有机碱，最多的情况是用酸性的缓冲液，PH值调到酸性的目的是使N（有机碱一般是含N化合物）结合质子，形成缔合物保留，所以有机碱的存在形式是阳离子。
还有一个问题，样品很“脏”，保留时间也是难于重现的，这可能是样品之间的基质效应影响，这种情况至于是为什么说实话我也没完全搞懂，咨询了很多人都说实际样品肯定有差异，我的理解是样品中的强保留杂质对柱子产生了“改性”影响，导致保留时间产生偏差。这不需要深究，我们只要保证样品尽量“干净”进LC分析就行啦。
至于流动相问题，平衡时间不够的问题等等这都很容易判断。我在这里不细说。事实上我在实验中发现进样量过大也会有保留时间偏移的问题，并且偏移程度不消小，我也在考虑这种现象的原因，也希望大家能帮助我。
还有一点，前面我有提到过“一个样品进6针算RSD”和“配制6个平行样品算RSD”，它们两者是具有不同意思的，前者评价的是仪器的紧精密度，而后者则是考察样品的重复性分析问题，后者的意义更大，如果仪器的精密度都不能保正，那做出的结果无任何意义可言。

十

今天继续跟大家交流我对LC的认识。大家知道样品前处理是很重要的一个过程，甚至比分析更重要，分析的程序可以按部就班的进行。下面讲下一些前处理的方法和经验；
固相萃取是一种比较好的萃取方式，它的作用是除去杂质和富集目标物，一般常用的固相萃取柱有C18柱，C18-/OH柱，阴离子交换柱，阳离子交换柱等等。C18柱也就是纯粹的反相保留机制，阴离子交换和阳离子交换保留机制依据形成离子缔合物，根据疏水效应得以保留。使用阴离子或阳离子交换柱最重要的有两点，这里我们以阳离子交换柱为例，第一点要注意的是将样品的PH值调节至酸性（PH值应小于其PKA值两个单位以上），目的是为了让目标物结合质子带上正电荷，以便和树脂上阳离子交换得以保留，第二点要注意的是洗脱是注意用大于样品PH值两个单位的溶剂洗脱，以便中和样品所带的正电荷。明白了这两点后其它的都不是问题。
使用大孔树脂先做预分离也是一个很好的前处理方式，它可以大大降低在进行LC分析时的基质效应，一般我们用湿法填柱，大家在填柱的时候遇到最大的问题可能是气泡难于排出。我们可以这样做，先往柱子里加半管水，然后把头大孔树脂加入进去，慢慢的把水排掉，利用排除水时可以不断的把气泡排尽，这真的是个好方法，大家在装柱的时候不妨运用下。像我在实验室做天然产物的预分离，AB-8大孔树脂用的最多，它是一种弱极性的填料，对于分离一些黄酮类化合物非常有帮助。
所以大家在做样品的前处理是可以根据样品的极性，疏水性，PKA值等等充分的利用这些前处理方法，做到心中有数。

十一

今天继续谈我对LC的肤浅认识：
1、灵活使用缓冲溶液
前几次我在认识中提到：“分析有机酸是把PH值调到3一般是可行的”，这是基于有机酸在反相柱上的保留一般都不强，所以加酸抑制电离，让有机酸以分子形式存在得以保留，但如果目标化合物的疏水性很强，依据疏水效应就能在反相柱上很好的保留，那就完全没必要调PH值了。有位版主的资料很好，我看了立马总结出了自己的想法：目标化合物分子量大于1000，考虑用凝胶色谱等等其他的方法。分子量小于1000是我们主要考虑的，如果目标化合物溶于有机溶剂，说明它的极性较弱或者中强（水的极性是最强的)，如果其疏水性不是太大的话考虑用正相色谱分离；如果目标化合物溶于水，说明它具有较强的极性，如果它在水中以分子的形式存在，那么依据纯粹的反相保留机制就可分离，也就是说不用加缓冲溶液，不用调PH值，仅仅依靠纯粹的反相保留。如果它可离子化，那么就要按照我前面总结的根据有机酸，有机碱的分析方法来分析，这里不累赘。我个人认为要达到这种境界：一看到目标物的结构，官能团等性质立马要能判断出主要依据什么保留机制，怎么选择流动相，怎么设置洗脱程序。能做到这样，说明你应用LC已经入门了。
2、必要的分析结果的能力
不光要会操作LC，会应用它，而且更重要的是对它的实验结果进行分析，我发现在论坛上一些人对于基本的概念还是模糊的，比如加标回收率，比如精密度实验，比重复性实验，比如稳定性实验，比如各种方法的实质。下面我再讲一遍，希望对大家有所帮助：首先是精密度实验，其实质是考察的仪器的精密度，也就是一个样品重复进6针，算RSD，它反应的是仪器的优劣，对样品说明不了任何问题，这点大家一定要记住。重复性实验是反映样品的，即是配置6个平行样品，按照相同的前处理步骤，最后计算RSD，它反映的是样品的重现性。其次关于加标回收率，这个我解释过一遍，详细解释比较麻烦，谁用得上的时候，如果有疑问加我QQ1002658908，我单独跟他解释。各种方法的实质，像外标法，内标法，标准加入法，等等。这里我详细讲下标准加入法，它其实跟做加标回收率很相似，都是向样品中加入标准物质，保证样品一样，加入不同浓度的标样，做标准曲线，最后可以得到样品的浓度，这种方法最大的优点是排除了实验条件或者样品基质效应所带来的误差，实验结果准确，但操作很麻烦，所以一般不用。

十二

在论坛上已经写了不少关于对LC的认识了，事实上我一直追求的是用最通俗的语言表达我的认识，因为硬生生的理论谁看了都讨厌，所以我尽量把理论都转化成我自己的话。希望大家多多指正。
事实上我是很反感照着药典或者什么资料完成自己的实验的，这可能与在实验室、毕竟不是检测机构的环境有关。但我想说的是必须得有自己的想法，因为你在实验中出现的问题谁也无法预料，我认为参考资料并加以自己的想法才是王道，药典是怎么来的？还不是人制定的，谁敢说那些制定药典的人水平能比我们高多少？对吧。
就像拿到一个物质，或者一个盲样我们完全可以按照自己的想法进行实验。如果这个物质的结构式我们已经知晓，就完全可以判断它PKA值，疏水性，溶解性等一些有用的信息，假如它的分子量大于2000，一般选择用凝胶色谱；假如它分子量比较大，疏水性基团较多，那流动相完全可以用有机相和水就搞定了；如果它在水中会解离，那一般是要加入缓冲盐的。很多人认为磷酸盐不好，我承认书上有理论是证明过它伤柱子，但我们仍然要用它，这个我已经解释过很多遍了，所以可以不用，但如果发现用其他的缓冲盐效果不好（像基线不稳，基线漂移），那么磷酸盐还得用，这就是实际实验中的问题，所以要灵活变通。如果目标物质的结构式不知晓，那完全可以根据它溶于水或有机溶剂来判断它极性的大小或疏水性的大小，也可以测出它在水中的PH值等等，掌握了更多的信息后我们完全可以进行实验，并且可以制定一套完整的分析方案，这里一些很简单的判断方式是要掌握的；例如目标组分在酸性条件下出峰慢而在碱性条件下出峰快那么它一般是有机酸，相反则是有机碱等等。
再比如梯度洗脱，记住最重要的原则就是保证分离度兼顾分离时间就行啦，像一般强保留的组分都是要走到100%的有机相的，所以先用100%有机相走个等度，看最后一个出峰的时间，那个时间就是走梯度的最大时间（初步认为，可以再调），然后保证第一个物质在3-5分钟出峰就行，至于怎么调都行，包括改变梯度陡度，等度梯度混用都行。所以不要拘泥于形式，多思考，你就会认识得更深刻，做LC的过程也就是个积累的过程，想想那些专家什么的也不过如此。当然这都是建立在具备强大的理论知识的前提下，肚子了没东西就没底气，所以大家也不能忽视理论的学习，万万不要觉得LC只是个实践的过程。
最后，大家有什么问题尽管给我提出来，能解决的我会在第一时间给大家解决，谢谢大家指正。

十三
今天继续谈下我对LC的认识，已经有很多天没写了。
首先完整阐述下流动相加缓冲盐的作用。大家都知道的是加入缓冲盐可以稳定杆PH值，改善峰型。它还有很多作用的，比如加入缓冲盐可以提高离子强度进而改善有些峰的前延和拖尾，原因是这些离子先和一部分硅羟基发生作用，可以避免有些目标物和硅羟基发生强烈的作用；并且缓冲盐的浓度越大，对于目标物的保留时间都是有影响的，可以使保留时间略微增大，原因是缓冲盐的浓度越大，相当于流动相的极性越大，这样对于纯粹的反相保留机制而言，流动相的洗脱能力是减小的，因而保留会增强；它还有一个作用就是用于梯度洗脱时可以减弱基线的漂移，我们知道：梯度洗脱基线的漂移是由于流动相A相（水相）和B相（有机相）的紫外吸收差异所导致的，有机溶剂的紫外吸收总是大于水，而走梯度时有机相的比例是逐渐增大的，这样由于紫外吸收的差异造成基线漂移，如果水相中加缓冲盐，便可以增大水相的紫外吸收，这样就可以通过A相与B相的“吸收匹配”来消除基线的漂移，所以我们看到梯度洗脱一般用缓冲盐还有这个作用。
第二谈下C18柱的问题，不同型号的C18柱是有差异的，这里我想谈下亲水的C18柱，这是先在碳十八烷基链上先键合了一些亲水的、极性的官能团，再将十八烷基链和硅胶键合的，根据相似相溶原理，键合极性官能团的C18柱当亲水性较强，并且具备较好的选择性。关于这些极性官能团的键合位置，大家要搞清楚，不是键合在硅胶上，而是键合在C18烷基链上的，因为此前有人在论坛上误导人，这里给纠正下。
这都是我的随笔，以后会逐渐将LC的问题和大家讨论，共同进步，谢谢。