六、毛细管电泳发展趋势
CE的应用十分广泛,现择一些重要应用及重要发展作简要介绍。
1、DNA分析
DNA分析包括碱基,核苷,核苷酸,寡核苷酸,引物,探针,单链DNA,双链DNA(DNA片段,PCR产物)分析及DNA序列测定。CZE和MECC通常用来分离碱基,核苷酸,简单的核苷酸等。CGE则用于较大的寡核苷酸,ssDNA,dsDNA和DNA序列分析。大片段DNA分析过去颇为困难,但又十分重要,因为人类染色体DNA在50—255Mbp范围内,用荧光显微镜可观察到单个大片段DNA分子的分析过程,对长度为166k碱基(bp)的T4dcDNA经消解后,从1.26到49.31kbp的8个片段只用8min就可分离。也有报道用CE结合原子力显微镜可进行单个DNA分子的分价。已有CE测定DNA序列的商品仪器面市,但快速测定DNA序列仍在研究中。采用毛细管电泳芯片,可更换的线性聚丙烯酰胺凝胶,350bp的DNA序列测定可在7min内完成,最小分离度为0.5。也有采用舰CEC—MS来研究带电和中性RNA和DNA的加合物。
DNA分析中CE分离,鉴别PCR扩增产物及DNA基因突变是其重要发展方向。CE用于点突变测定有单链构象多态性分析(SSCP)和限制片段长度多态性分析(RFLP)等。CE也用于法医领域亲子鉴定和甄别罪犯等。
2、肽和蛋白分析CE在生物大分子蛋白和肽的应用可概括为两大方面:一是其结构的表征,二是研究相互作用。蛋曰质一级结构表征的内容包括纯度,含量,等电点,分子量,肽谱,氨基酸序列和N—端序列的测定等,CE已广泛用作最有效的纯度检测手段,它可检测出多肽链上单个氨基酸的差异。用CIEF测定等电点,分辨度可达0.01pH单位。尤其是肽谱用CE/MS联用进行分析,可推断蛋白的分子结构。蛋白结构的完全表征尚需采用多种CE模式,结合多种仪器联用,特别是和MS,TOF/MS的联合使用或联用,才能得到正确结果。蛋白,特别是基因工程所得蛋白药物的微多样性(非均一性)是影响其质量的因素之一。CE能较好地显示微多样性。用CE进行蛋白本身反应及和小分子相互作用研究是研究热点,如蛋白结合或降解反应,酶动力学,抗体—抗原结合动力学,受体—配体反应动力学等,蛋白和DNA分析始终是CE研究的重点,今后会有更多的研究。
3、手性分离
手性对映体分离,鉴定有巨大的应用价值,已成为医药领域内一个重要课题。第11届国际CE大会(HPCE,98)论文中,手性分离论文约占10%,可见手性分离受到重视。除CIEF外,其余五种模式均可用于手性分离。常用的手性选择剂有环糊精及其衍生物,冠醚类,手性选择性金属络合物,胆酸盐,手性混合胶束,蛋白等。我国在环糊精类衍生物分离手性对映体方面作了大量,深入的研究工作,达到国际先进水平。当前最新进展是采用大环抗菌素作手性选择剂,如用万古霉素,利福霉素,硫酸新霉素,硫酸卡那霉素,瑞斯西丁素等来进行手性分离,并探讨了分离机理。还有采用线性多糖,如角叉菜胶来分离弱碱性手性对映体。CE进行手性分离,通常均在运行缓冲液内加人手性选择剂,在操作及分离效率上均优于HPLC手性分离。今后CF手性分离将会在发展更多手性选择剂,更深入地探讨分离机理及手性药物在体内的作用及代谢等方面开展研究。
4、药物分析和临床检测目前CE在药物和临床研究领域已成为不可缺少的有力手段,但在医药领域尚未确定为法定方法,故未得到广泛使用。医药领域内大量研究工作表明CE正在走向成熟。CE已用于几百种药物及各种剂型中丰药成分分析,相关杂质检测,纯度检查,无机离子含量测定及定性鉴别等CE成为法定方法,最可能的突破点是手性药物的鉴别;基因工程药物的纯度检测和分子量测定;HPLC或其它方法难于解决的药物质量难题;如主成分峰后尾随的痕量杂质,HPLC难于准确定量,CE高柱效则可迎刃而解。现在采用EOF内标及修正计算峰面积等方法己能很好解决CE定量问题。研制的96支毛细管的CE仪器一旦实现商品化,更有利于CE在制药工业中大规模使用。CE/MS联用将促进CE快速发展。CE在临床化学中除进行临床分子生物学测定外,也广泛用于疾病临床诊断,临床蛋白分析,临床药物监测和药物代谢研究。药物代谢研究对CE是一个挑战,虽有不少成功报道,但在提高灵敏度,解决蛋白吸附等方面仍待改进。
5、环境监测和离子分析CE在环境监测中的应用也日趋增多,目前主要集中在用各种模式,包括CEC分离监测土壤等环境中多环芳烃(PAHs),可在10min内分离16种多环芳烃。CE在环境监测中应用还需提高灵敏度和发展浓缩,富集方法。毛细管离子分析(CIA)采用间接紫外法或间接荧光法,具有高效,快速的优势。最成功的例子是2.9min内分离36种阴离子,1.8min内分离19种阳离子。CIA有特色,如在大量有机硒(硒酸酯多糖)存在下,可用CIA法定量测定不同价态的痕量无机硒,这是
原子吸收光谱和
离子色谱尚未解决的难题,目前CIA及CE/MS用于形态分析报道也日益增多。
CE较重要的应用还有糖的分析,目前最成功的是用APTS作糖的衍生化试剂,标记后用LIF可进行单糖和多糖的测定。
6、单细胞,单分子监测单细胞,单分子检测是CE研究达到的最高境界,对生命科学和化学有巨大潜在意义。已报道对单个肾上腺细胞,红细胞,白血病细胞,淋巴细胞,嗜铬细胞和胚胎细胞等均取得成功。如用CE测定单个淋巴细胞中的乳酸脱氢酶同工酶抖,用CZE间接紫外法监测钠离子和钾离子透过胚胎组织膜的传送,单细胞监测或许会对细胞水平的药理学,了解生命过程提供—种活体检测手段。单个DNA分子的检测早有报道,最近E。Yeung报道用CE监测单个蛋白分子,是一突破性的进展,表明科学家向研究单分子间的各种化学和生物反应跨出了决定性的一步。
7、毛细管电泳芯片(Chip)
将所有的化学反应都集成在一小块玻璃芯片上,建立有一个实验室功能的芯片将是CE发展的前景,如测DNA序列的芯片在3cm距离内,只加20v/cm的电压,就可在13min内测定400bp的序列,分离度大于0.5,柱效高于3000万理论培板。将PCR和CE集成在—起的芯片也已成功,还有将Chip和MS联用,极大扩展了Chip的前景。虽然目前各种检测器对Chip来说,体积不相称。但随着检测器的微型化(如质谱仪已可做到如手提箱大小),Chip的优势会更加明显,这也是科学家集中力量发展Chip之理由。
本世纪是生命科学大发展的世纪。完成人类基因组计划后,后基因时代的基因组学和蛋白组学将快速发展,功能基因的分离,检测,功能蛋白的分离,测定对CE提出更高的期望,小chip将是CE发展的一个重要趋向,将一个实验室的工作集成到一块很小的芯片上,能使仪器微形化。可以预见,不久就会出现各种专用的基因检测,疾病诊断的小型chip及仪器。另一方面,96支或更多支毛细管的毛细管阵列电泳仪将会用于药厂中产品质量检测及大量医学临床检验。将会研制适合CE用的各种检测器,以进行单细胞和单分子的检测。单细胞检测为在分子水平上了解细胞的各种行为提供了强有力的工具,而单分子检测为在单个分子水平上开展化学动力学,反应动力学等研究提供了可能性。此外,CE在环境科学中也会有较大发展余地。
CE是正在发展的研究领域,有很多理论及实际问题有待解决,更需其它领域的研究人员来扩大其应用范围。CE的成长将为生命科学,材料科学,环境科学提供又一强有力的研究手段,CE也在不断解决难题的过程中得到发展。