主题：【原创】食品质量与安全检测 快速筛查

（一）食品质量安全快速筛查技术之一：ELISA试剂盒技术 

  原理：酶联免疫分析法：(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA) 是将抗原与抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的检测技术。具体是将抗原或抗体结合到某固相载体（保持其免疫活性），使受检标本和酶标抗体或抗原与固相载体表面的抗原或抗体起反应，然后洗涤，使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开。因最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例，所以可根据加入底物后，酶催化反应产生有色物质颜色的深浅进行定性或定量分析。

  现状：ELISA技术仍因其操作程序的规范化、简单化和检测的高灵敏性，表现出独特的优势，并在药物残留、生物毒素、食品添加剂和人兽共患疾病病原体的快速检测和分析等食品安全性检测领域中得到广范应用。

ELISA试剂盒法：孔雀石绿、结晶紫类物质检测法

  孔雀石绿（Malachite Green,MG）、结晶紫（Gentian Violet,CV）作为杀真菌剂和消毒剂被广泛用于水产养殖。其被鱼体吸收后，会代谢为危害更大的隐性孔雀石绿（LMG）和隐性结晶紫（LCV），并沉积于脂肪组织，对人畜具有致畸、致癌和致突变的影响，因而在许多国家已被禁用，如欧盟、美国已宣布禁止其在经济鱼类（观赏鱼除外）养殖过程中使用；我国质检总局、国家标准委则共同发布实施了GB/T 19857—2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》国家标准；韩国孔雀石绿、结晶紫的限量标准为2μg/kg。鉴于隐性孔雀石绿和隐性结晶紫危害更大，同时检测孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫和隐性结晶紫更为科学。

  目前，检测水产品中孔雀石绿、结晶紫类物质的常见方法有ELISA试剂盒、胶体金试纸和仪器检测三类，本文从灵敏度、特异性、准确度和精密度、检测时间、检测成本、所需设备等方面比较了ELISA方法与其他两种方法，以期为孔雀石绿、结晶紫类物质检测提供借鉴。

  试验方法

  选取市面上具有代表性的一种可检测孔雀石绿的胶体金试纸，本公司的孔雀石绿检测试剂盒（I）、一种进口ELISA试剂盒(Ⅱ)、一种国产ELISA试剂盒（Ⅲ）以及仪器方法（HPLC和HPLC-MS）进行试验。阴性样本通过高效液相色谱（HPLC）检测后定值。

    试验结果

  灵敏度的比较

  用ELISA试剂盒进行20组阴性样本的检测，检测限是通过20份空白样品的测定平均值加3倍标准差计算而来；胶体金检测卡进行阴性样品添加实验，包括该浓度、50%该浓度、150%该浓度以及300%该浓度，检测限为使用说明书上标注的浓度；仪器检测由于费用较高，检测限参考国标。

  试验发现：胶体金检测卡的组织检测限为5μg/kg；我公司的ELISA产品的组织检测限为0.135μg/kg，进口对比ELISA检测产品的组织检测限为0.082μg/kg，国产对比ELISA检测产品的组织检测限0.267μg/kg； GB/T 19857-2005规定孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫和隐性结晶紫的测定方法为液相色谱-串联质谱和高效液相色谱法，液质联用法的检测限均为0.5µg/kg，高效液相色谱法的检测限为2μg/kg。

特异性的比较

  系列稀释的竞争物溶液用胶体金检测卡检测；ELISA试剂盒抗体特异性用交叉反应率（IC50（孔雀石绿）/IC50（竞争物）×100%）表示。以系列稀释的竞争物溶液作被检抗原，绘制出各自的标准曲线，得到每种竞争物的IC50值，然后再利用公式求出每种竞争物的交叉反应率。

  胶体金试纸可直接检测孔雀石绿，对于隐性孔雀石绿，可按照说明书提到的方法进行样品处理，然后进行检测，但对浓度为20μg/kg的结晶紫和隐性结晶紫，胶体金试纸则无特异性反应；我公司的试剂盒对MG、CV以及LMG（氧化后）的交叉反应率为100%；进口试剂对MG、LMG（氧化后）交叉反应率为100%，对CV的交叉反应率仅为40%；国产试剂盒对MG的交叉反应率为100%，对CV的交叉反应率为90%，对LMG和LCV的交叉反应率则小于1%。

图为 抗体的交叉反应示意图

说明：Ag A、Ag B是具有相同抗原表位的不同抗原，Anti-A Ab既可与Ag A结合也可以与Ag B结合，即Anti-A Ab与Ag B有较高的交叉反应；Ag C具有相似的抗原表位，Anti-A Ab与Ag C也有一定的交叉反应。

  准确度和精确度的比较

  胶体金试纸与我公司ELISA试剂盒的对比试验及结果：将孔雀石绿、隐性孔雀石绿标准品添加到鱼肉组织样本中，进行20组阴性样本以及20组添加阳性样本的检测。检测20份阴性样品，我公司ELISA试剂盒初检结果为95%阴性，并且复检后的阴性样品符合率达100%；胶体金检测产品初检阴性样品符合率为85%，复检后达95%；检测20份阳性样品，我公司ELISA试剂盒初检结果为100%阳性，胶体金试纸初检阳性样品符合率为95%，复检后达100%。

  三家ELISA试剂盒的对比实验及结果：在阴性鱼肉样品中，将孔雀石绿添加至0.3μg/kg、1μg/kg，并且每个浓度样本进行6个重复，计算样品添加回收率及批内变异系数。结果发现，我公司ELISA试剂盒、进口对照ELISA试剂盒及国产对照ELISA试剂盒，在0.3μg/kg和1μg/kg浓度处的准确度范围分别为75%～105%、80～95%和60～110%，批内变异系数分别是≤15%、≤11%和≤20%。

  样品提取的比较

  根据胶体金、各ELISA检测试剂盒说明书上的方法以及国标中液相色谱-串联质谱和高效液相色谱中的方法进行样品前处理，记录所用时间。

  试验发现，胶体金试纸需要使用层析柱进行样品纯化，处理单个样品时间约需20min，单次不适合处理大批量样本；建立的ELISA方法需要的样品前处理时间约为20min，可同时处理与检测多个样本；按照国标操作，液相检测方法处理单个样品时间约为30min，但由于需要过净化柱，处理较为繁琐。总体来看，处理40个样品，胶体金方法共用时间约3.5h，ELISA方法共用时间约2h，液相检测时间约5h。

检测时间的比较

  检测单份样品，胶体金试纸检测时间约需5～10min，可同时检测多个样品；ELISA方法检测时间约需90min，可同时检测多个样品；HPLC及液质联用的检测时间约需20min，不能同时检测多个样本。检测40个样品，胶体金方法共用时间0.5h，ELISA方法共用时间1.5h，液相检测时间需要约13h。

  检测成本的比较

  通过市场调研获得的胶体金试纸、ELISA检测产品以及仪器检测的费用：孔雀石绿胶体金快速检测卡中，水样检测卡为20～30元/份，组织检测卡为40～50元/份；孔雀石绿ELISA检测试剂盒报价为4000～5000元/盒，可以检测40余份，即100元/份；HPLC检测费用为200～300元/份，LC-MS检测费用约2000～3000元/份。

  所需设备比较

  胶体金法无需仪器、设备；ELISA法仅需配备酶标仪及简单的实验室设备，仪器检测法则需要配备昂贵的高效液相及液质联用设备。

试验结果讨论与结论

    由以上试验结果可以看出：（1）在检测灵敏度方面，ELISA试剂盒与HPLC-MS在同一水平，明显高于胶体金产品。（2）在准确度和精密度方面，胶体金法假阳性率高于ELISA法，二者均不产生假阴性。另外，我公司的ELISA检测试剂盒回收率及精密度接近进口试剂盒水平，优于国产试剂盒。（3）在检测能力方面，胶体金法仅能分别检测MG和LMG（处理后），而我公司的ELISA试剂盒与进口对照试剂盒均可同时检测MG、CV、LMG（氧化后），进口对照ELISA试剂盒对CV的交叉反应率偏低，国产对照ELISA检测产品仅可同时检测MG、CV。（4）在检测时间方面，以检测40个样品为例，由于采用ELISA法无需过净化柱，因而可同时处理大批样品，处理时间较短；而胶体金法和仪器检测法，需过柱净化，不适合同时处理大批样品，处理时间较长。检测时间则是胶体金检最短，ELISA检测时间略长，仪器检测法最长。总体来看，处理大批样本时，ELISA试剂盒法（3.5h）和胶体金方法检测时间（4h）均较短，仪器方法明显检测时间最长（18h）。

    总之，仪器设备昂贵，并且操作复杂，对操作人员的要求较高，虽然检测准确，但并不适合广泛推广，主要适用于监督管理部门进行确证；胶体金法检测快速，价格便宜，但灵敏度低且容易出现假阳性，因此，仅适合食品企业进行快速筛选；与以上两种方法相比，ELISA试剂盒法操作简便、快速，无需专业人员操作，仅需配备基础仪器设备，因此非常适合在食品企业中推广，同时由于其适合大批量样本筛选，因此配合仪器，可广泛应用于检验检疫、商检执法等部门，是非常具有推广价值的食品安全快速筛查方法。

(二)食品质量与安全快速筛查技术之二：近红外光谱

    【工作原理】

　　近红外光谱主要是由于分子振动的非谐振性使分子振动从基态向高能级跃迁时产生的。近红外光谱记录的是分子中单个化学键的基频振动的倍频和合频信息，它常常受含氢基团X-H(X-C、N、O）的倍频和合频的重叠主导，所以在近红外光谱范围内，测量的主要是含氢基团X-H振动的倍频和合频吸收。

    获得近红外光谱主要应用两种技术 透射光谱技术和反射光谱技术。透射光谱（波长一般在780~1100nm范围内）是指将待测样品置于光源与检测器之间，检测器所检测的光是透射光或与样品分子相互作用后的光（承载了样品结构与组成信息）， 若样品是混浊的，样品中有能对光产生散射的颗粒物质，光在样品中经过的路程是不确定的，透射光强度与样品浓度之间的关系不符合Beer定律。对这种样品应使用漫透射分析法。 反射光谱（波长一般在1100~2526nm 范围内）是指将检测器和光源置于样品的同一侧，检测器所检测的是样品以各种方式反射回来的光。物体对光的反射又分为规则反射（镜面反射）与漫反射。 规则反射指光在物体表面按入射角等于反射角的反射定律发生的反射，漫反射是光投射到物体后（常是粉末或其它颗粒物体），在物体表面或内部发生方向不确定的反射。应用漫反射光进行的分析称为漫反射光谱法。此外，还有把透射分析和漫反射分析结合在一起的综合漫反射分析法和衰减全反射分析法等。

【技术特点】

    近红外光谱技术之所以成为一种快速、高效、适合过程在线分析的有利工具，是由其技术特点决定的。 近红外光谱分析的主要技术特点如下：

（1）分析速度快，测量过程大多可在1min内完成。

（2）分析效率高，通过一次光谱测量和已建立的相应校正模型，可同时对样品的多个组分或性质进行测定 提供定性、定量结果。

（3）适用的样品范围广，通过相应的测样器件可以直接测量液体、固体、半固体和胶状体等不同物态的样品光谱测量方便。

（4）样品一般不需要预处理，不需要使用化学试剂或高温、高压、大电流等测试条件，分析后不会产生化学、生物或电磁污染。

（5）分析成本较低（无需繁杂预处理，可多组分同时检测）。

（6）测试重现性好。

（7）对样品无损伤，可以在活体分析和医药临床领域广泛应用。

（8）近红外光在普通光纤中具有良好的传输特性，便于实现在线分析。

（9）对操作人员的要求不苛刻，经过简单的培训就可胜任工作。

    近红外光谱技术存在的问题：

（1） 测试灵敏度相对较低，被测组分含量一般应大于0.1%。

（2）需要用标样进行校正对比，很多情况下仅是一种间接分析技术。

【仪器分类】
 
    根据分光系统，近红外光谱仪器可分为固定波长滤光片、光栅色散、快速傅立叶变换和声光可调滤光器（AOTF）四种类型。光栅色散型根据使用检测器的不同又分为扫描式和固定光路式两种。

    根据测试方法，近红外光谱法主要分为透射测定法，漫透射测定法和反射测定法3种。透射测定法用于透明样品的分析，样品浓度与对光的吸收关系符合比尔定律。漫透射测定法，由于样品中含有光散射物质，光在穿透分析样品时，除了吸收外还有多次散射，比尔定律不适用。反射测定法，近红外光照射到样品表面后，由于样品表面状态和结构的不同，光线会发生多次反射。

【对硬件和软件的要求】

    在硬件上，光栅型近红外光谱仪的设计与紫外，可见光谱仪的设计极为相似，但使用的光栅，滤光片和检测器不同（有些需要更换光源）。 目前FT-IR光谱仪主要用于中红外区，但只要更换一些光学元件（光源、分束器及检测器）并配合适用的软件，就可扩展到近红外区，AOTF 是一种新的分光方法，已经有厂家将其用于中红外和近红外光谱仪器。 使用滤光片的仪器，主要用于对仪器要求不太高的专项测量。

    在软件上，应该设计光谱测量通用软件，化学计量学光谱分析软件和仪器自检系统。光谱测量通用软件完成近红外光谱图的获取、存储等常规功能，化学计量学光谱分析软件完成对样品的定性或定量分析，是近红外光谱快速分析技术的核心。常用的化学计量学方法有：多元线性回归（MLR），主成分分析（PCA）、偏最小二乘法（PLS）、人工神经网络（ANN）和拓扑（Tonological)等。 所采用的算法的好坏(收敛速度)直接影响仪器的分析速度，所以在这一方面需要加强研究。仪器自检系统完成仪器性能状态的自我检测，判定仪器是否符合样品的测试条件，仪器在硬件上要有相应的功能。

    另外，还需要建立相应的模型库（训练集）。这项工作需要具有相应领域专业知识的人才􀁯大量有代表性的样品，准确的标准分析数据（主要是化学分析）数据建模并建成相应的光谱数据库，才有可能完成。