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主题：【原创】【第三届原创参赛】标准曲线体积法和浓度法之比较

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lingshike

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发表于：2010/09/30 17:28:55 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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【第三届原创参赛】标准曲线体积法和浓度法之比较

1、药典中标准曲线的规定。

2010版中国药典一部附录130页，中药质量标准分析方法验证指导原则中线性内容如下：

2005版中国药典一部附录114页，中药质量标准分析方法验证指导原则中线性内容如下：

通过上面两个版本的药典内容的比较，我们可以发现关于线性的规定是完全相同的。

2、标准曲线体积法和浓度法

体积法：就是用同一对照品，在色谱仪中注入不同的体积，得到相应不同的峰面积，再用进样质量和峰面积做图，求出标准曲线。

浓度法：将一对照品稀释至不同浓度，在色谱仪中注入相同体积，得到相应的峰面积，再用进样浓度和峰面积作图，求出标准曲线。

这两个方法，从上面药典的上内容来看，浓度法显然符合官方的规定，体积法就属于投机取巧的范围了，它与药典的精密称样是不一致的，它只是精密取样而已，而且是没有一系列供试品的，就只有一个对照品。但是我们看文献，发现还是有很多的文章采用了这种方法，究其原因，这个方法省时，不用再配制其他对照品；省钱，不用高浓度的对照品。

我个人而言，两种方法的最终目的一致，在理论上最终都是进样质量和峰面积的关系，两种方法都可以用。但是体积法有时并不能做出很好的线性，我前段时间就遇到了。为此，我将实验结果和大家一起分享。

其实这个话题，在我们论坛早就讨论过了。详见：http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20090121/1707608/

3、标准曲线体积法

对照品：绿原酸和橙皮苷（均购置中国药品生物制品检定所，批号略）

色谱条件：安捷伦1100（四元泵，真空脱气机，自动进样器，柱温箱，紫外检测器），月旭XB-C18,5μm，4.6*250mm，柱温30℃，流速1ml/min，流动相乙腈和0.1%磷酸，比例按表1。检测波长按表2。运行时间30min，后运行10min。

表1

时间（min）	乙腈比例（%）
0	10
12	10
12.5	28
19	16

表2

时间（min）	检测波长（nm）
0	328
20	283

因为同时测定两种物质，我配置了一个混标，想用体积法做标准曲线。一下就可以两个都做完，多省事啊。于是我将混标分别进样1、3、5、10、15、20、30μl。结果图谱如下（图中杂峰很多）：

图1 1μl 混标色谱图

图2 3μl 混标色谱图

图3 5μl 混标色谱图

图4 10μl 混标色谱图

图5 15μl 混标色谱图

图6 20μl 混标色谱图

图7 30μl 混标色谱图

上述7图的峰面积汇总如下：

表3 混标体积法峰面积

进样体积（μl）	绿原酸峰面积	橙皮苷峰面积
1	128.9	125.2
3	394.8	491
5	632.8	834
10	1110.5	1743.6
15	1163.9	2482.3
20	1430.9	2577.7
30	1730.8	2612.7

以进样体积为横坐标，峰面积为纵坐标，用EXCEL做图如下：（其实应该折算成进样质量再与峰面积作图，但各进样体积浓度一致，相关系数是不变的。）

通过上述四图，我们可以看出，标准曲线很不好。相关系数达到三个9的一个都没有。而且从图上我们可以看出，前面进样量小的数针，相关系数较高。随着进样体积的增大，峰面积并不与进样量成正比，反而趋于饱和，有着使标准曲线弯曲，变成与横坐标平行直线的趋势，

由此，提示我们，用体积法做标准曲线并不可靠。进样体积与峰面积不一定成正比。

4、标准曲线浓度法

对照品，色谱条件同上。（本文只写橙皮苷的浓度法标准曲线，绿原酸的略）

称取4.11mg的橙皮苷对照品，超声助溶，甲醇定容至25ml。然后取适量分别稀释2、5、10、25倍。分别取10μl注入色谱仪，测定峰面积。色谱图如下：

图8 橙皮苷色谱图

图8 橙皮苷稀释2倍色谱图

图8 橙皮苷稀释5倍色谱图

图8 橙皮苷稀释10倍色谱图

图8 橙皮苷稀释25倍色谱图

将上述各浓度的峰面积统计如下：

表4 橙皮苷浓度法峰面积

稀释倍数	进样浓度（mg/ml）	绿原酸峰面积
1	0.1644	2458.8
2	0.0822	1270.7
5	0.03288	514.7
10	0.01644	237.1
25	0.006576	90

以上表做标准曲线如下：

通过这条浓度法标准曲线我们可以看出，相关系数达到了0.9995，表明线性良好。

同时，将这条曲线与上面的体积法所做的标准曲线比较，浓度法的结果要好的多，且符合规定。体积法和浓度法孰优孰劣，一目了然。

5、总结

通过上面体积法和浓度法的比较，可以看出浓度法是优于体积法的，体积法存在进样量与峰面积不一定成比例的缺点。但是如果这个缺点改正了，那两者应该是一致的。而且我曾经在另一台色谱仪上做过体积法的标准曲线，相关系数也达到了0.9998，不过体积法的峰形随着体积的增大而变胖，很难看。

在实验过程中，可以先做体积法，不用配置新的对照品，如果不行，再做浓度法。如果没有现成配置好的对照品，则首选浓度法。