头孢替安是杀菌性头孢菌素类广谱抗生素，头孢替安不但对革兰氏阳性菌有效，而且对革兰氏阴性菌。如流感嗜血杆菌，大肠杆菌、克雷白氏菌、奇异变形杆菌等的作用更强。对肠杆菌，枸橼酸杆菌、吲哚阳性变形杆菌等，也有抗菌作用头孢替安在肺中药物浓度较高，其它脏器和肌肉也有一定的浓度。临床应用于敏感菌所导致的感染，如肺炎、支气管炎、胆道感染、腹膜炎、尿路感染以及手术后或外伤引起的感染和败血症等。其基本结构同已上市的的头孢菌素类抗生素一样，头孢替安也会形成高分子聚合物，也会在临床使用中引发速发型过敏反应。对患者危害极大。已有的注射用盐酸头孢替安国家药品标准未将盐酸头孢替安高分子聚合物列为检定项目，国内的药学研究也未见头孢替安高分子聚合物的研究和报道。从临床用药安全性考虑，根据中国药典2010年版二部附录凝胶色谱原理。采用常用的葡聚糖凝胶G-10检测聚合物时由于头孢替安分子结构自身的原因，头孢替安不能完全缔合，因些我们采用高效分子排阻色谱法，以球状蛋白色谱用亲水硅胶为填充剂 TOSOH TSKgelG2000SW（7.5*300mm），测定注射用盐酸头孢替安高分子杂质

1．仪器与试剂

（1）仪器：岛津LC-10ATvp泵

岛津SPD-10AVP紫外可见光多波长检测器

浙大2010色谱数据工作站

色谱柱：TOSOH TSKgelG2000SW（7.5*300mm）

（2）试剂：乙腈（色谱纯，天津市四友生物医学技术有限公司）

磷酸氢二钠（分析纯，北京化学试剂公司）

磷酸二氢钠（分析纯，北京化学试剂公司）

双蒸水（自制）

2 色谱条件

色谱柱：TOSOH TSKgelG2000SW（7.5*300mm）

流动相：磷酸盐缓冲液（p H:6.8）[0.002mol/L磷酸二氢钠溶液-0.002mol/L磷酸氢二钠溶液（50：50）]-乙腈（90：10）为流动相

检测波长：254nm；

流速：1.0ml/分钟

进样量：20 ul。

3 试验方法与结果

3.1色谱条件的优化

3.1.1离子强度的选择：

1、p H 6.8 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(0.1mol/L磷酸二氢钠-0.1mol/L磷酸氢二钠50：50)

2、p H 6.8 0.05mol/L磷酸盐缓冲液(0.05mol/L磷酸二氢钠-0.05mol/L磷酸氢二钠50：50)-乙腈（90：10）

3、p H 6.8 0.025mol/L磷酸盐缓冲液(0.025mol/L磷酸二氢钠-0.025mol/L磷酸氢二钠50：50)-乙腈（90：10）

4、p H 6.8 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(0.01mol/L磷酸二氢钠-0.01mol/L磷酸氢二钠50：50)-乙腈（90：10）

5、p H 6.8 0.005mol/L磷酸盐缓冲液(0.005mol/L磷酸二氢钠-0.005mol/L磷酸氢二钠50：50)-乙腈（90：10）

6、p H 6.8 0.002mol/L磷酸盐缓冲液(0.002mol/L磷酸二氢钠-0.002mol/L磷酸氢二钠50：50)-乙腈（90：10）

7、p H 6.8 0.001mol/L磷酸盐缓冲液(0.001mol/L磷酸二氢钠-0.001mol/L 磷酸氢二钠50：50)-乙腈（90：10）

我们分别采用上面不同缓冲液浓度的流动相进行进样分析。

供试液的配制：取本品适量（约相当于头孢替安50mg）,精密称定,置100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度,摇匀作为供试品溶液,(临用新制)，精密量称20ul,在上述色谱条件下分别进行检测。结果见下表1。

表1 离子强度的选择

从试验结果可见：在0.1mol/l磷酸盐缓冲液，用流速0.5ml/分钟时主峰出峰时间较长，峰拖尾严重，因此加入有机溶剂改善主峰的出现时间，相同比例时，随着缓冲盐浓度的减少，主峰出峰时间越提前，拖尾因子越变小，以至变化到出现前沿，分离度也随着缓冲盐浓度的减小而得到改善。综合上面的试验，我们选择：0.002mol/L 磷酸盐缓冲液液-乙腈（90：10）为最佳的色谱条件，并进行下一步的色谱条件摸索和优化。

3.1.2 pH 的选择

依据上面离子强度的选择，采用最优条件：p H 6.8 1mmol/l磷酸盐缓冲液液(1mmol/L磷酸二氢钠-15mmol/L磷酸氢二钠50：50)-乙腈（90：10），在此基础上调节溶液的酸碱度，以优化更好的色谱条件。

1、p H 6.0 0.002mol/L磷酸盐缓冲液(0.002mol/L 磷酸二氢钠-0.002mol/L磷酸氢二钠50：50，调节p H 6.0)-乙腈（90：10）

2、p H 6.5 0.002mol/L磷酸盐缓冲液(0.002mol/L磷酸二氢钠-0.002mol/L磷酸氢二钠50：50，调节p H 6.5)-乙腈（90：10）

3、p H 6.8 0.002mol/L磷酸盐缓冲液(0.002mol/L磷酸二氢钠-0.002mol/L 磷酸氢二钠50：50，调节p H 6.8)-乙腈（90：10）

4、p H 7.7 0.002mol/L磷酸盐缓冲液液0.002mol/L磷酸二氢钠-0.002mol/L磷酸氢二钠50：50，调节p H 7.5)-乙腈（90：10）

我们分别采用上面不同p H的流动相进行进样分析。

供试液的配制：取本品适量（约相当于头孢替安50mg）,精密称定,置100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度,摇匀作为供试品溶液,(临用新制)，

表2酸碱度的选择

根据试验结果：随着酸碱度增大拖尾因子变小，至酸碱度为7.5时，主峰出现前沿现象，酸碱度为6.0至6.5时，主峰均与质杂峰出现重叠现象，酸碱度为6.8时，各杂质峰之间分离完好，主峰拖尾因子及分离度试验均良好。

3.3 系统适用性试验

取本品适量,精密称定,加水溶解并定量稀释制成每1ml中含头孢替安0.5mg的溶液,取供试品溶液10ml，置80^oC水浴加热2分钟,取出放冷，取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图；结果理论板数按头孢替安峰计算为12697.3，头孢替安与相邻杂质峰的分离度为：1.723。

试验结果表明：该特殊系统适用性试验分离能力良好，能满足试验。

系统适用性图谱

3.4空白溶剂 精密吸取溶剂20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。

结果：空白溶剂未见有吸收峰，表明空白溶剂对高分子杂质测定无干扰。

3.5 空白辅料 按处方精密称取空白辅料约10mg置100ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，吸取溶剂20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。

结果：空白辅料未见有吸收峰，表明空白辅料对高分子杂质测定无干扰。

3.6 进样精密度

取头孢替安对照品约25mg,精密称定,置50ml的容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀（作为贮备液）；精密量取上述贮备液1ml置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度,作为对照溶液，精密吸取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，头孢替安峰面积值的相对标准偏差应小于5%，结果见下表3。

表3进样精密度试验

次数	1	2	3	4	5	6
A	172672.4	178122.4	171624.6	171972.7	171199.5	172584.7
RSD（%）	1.45

3.7 线性范围

精密量取上述进样精密度头孢替安对照品贮备液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8 ml、 1.0ml、1.2ml、 1.4ml、1.6ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度。分别量取20ml注入液相色谱仪，记录峰面积，结果如下：表4。

表4线性测定结果

编号	C(mg/ml)	峰面积 A
1	1.01	33444.2
2	2.01	65789.6
3	3.02	96039.3
4	4.02	126549.2
5	5.03	162823.1
6	6.0	192281.2
7	7.02	224261.3
8	8.03	250844.1

以峰面积对进样浓度计算，线性方程为：y=31333.5x +2572.6，相关系数r=0.9997。

从以上结果看出，头孢替安浓度在1.0mg/ml～8.0mg/ml范围内，呈良好的线性关系。

3.8重复性试验

对照液：取头孢替安对照品约25mg,精密称定,置100ml的容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述贮备液2ml置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度,作为对照溶液，

供试液：精密称取注射用盐酸头孢替安适量（批号090301）（约含头孢替安50mg）,置100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀,作为供试品溶液,(临用新制)。

重复配制6个样品。取对照溶液20ul注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的25%，精密量取供试品溶液与对照溶液各20ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图，计算保留时间小于头孢替安峰的各杂质和的百分含量，,所得6份供试液的相对偏差应不得大于5%。结果见表5。

表5 重复性试验结果

测定次数	1	2	3	4	5	6
杂质总和%	0.431	0.435	0.426	0.437	0420	0.427
RSD	1.47

从表中结果可见，本方法测定高分子杂质重复性良好，可满足测定的要求。

3.9.溶液稳定性试验

对照液：取头孢替安对照品约25mg,精密称定,置100ml的容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述贮备液2ml置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度,作为对照溶液，

供试液：精密称取注射用盐酸头孢替安适量（批号090320）（约含头孢替安50mg）,置100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀,作为供试品溶液,(临用新制)。

取对照溶液20ul注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的25%，精密量取供试品溶液与对照溶液各20ul分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试液在室温条件下分别于0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0小时精密吸取样品溶液20μl注入液相色谱仪进样,计算保留时间小于头孢替安峰的各杂质和的百分含量，结果见表6。

表6 溶液稳定性试验结果

时间（小时）	0	0.5	1	2	4	6
杂质总和%	0.421	0.700	0.716	0.945	1.244	1.768

从表中结果可见，溶液在室温条件下放置0.5小时，高分子杂质已增加0.27%，因此在进行高分子杂质检测时，溶液应临用新配。

3.10. 最小检出限:取头孢替安对照品适量，用流动相配制成一定浓度的溶液，精密量取20ul，注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度使样品的峰高为基线噪音的3倍。检测限为0.2ng。

4.试验结论: 高效分子排阻色谱法测定注射用盐酸头孢替安高分子杂质方法简便、系统适用性良好；操作迅速；检验
结果准确，方法可靠，适用于盐酸头孢替安的质量控制。

5.参考文献

1、《美国药典USP28》盐酸头孢替安质量标准

2、注射用盐酸头孢替安质量标准（JX20050205）

3、蔡姗英、胡昌勤，β-内酰胺类抗生素中高分子聚合物的分离分析方法研究进展广东药学院学报2002年6月第18卷第2期，138~141。

4、霍秀敏β-内酰胺类抗生素中高分子杂质的研究.药物评价2005年第2卷第5期. 324~326。

5、《日本药典15版》盐酸头孢替安质量标准

6、顾立素、胡昌勤、金少鸿，安美汀中高分子杂质的分离分析和质量控制药物分析杂志，2001、21（1），13~15

7、注射用盐酸头孢替安质量标准WS-124(X-104)-2002