主题：【第六届原创】衍生化气相色谱质谱联用同时检测动物源性食品中喹乙醇和卡巴氧代谢物残留

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发表于：2013/07/24 09:53:02 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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摘要：建立了可以同时检测动物源性食品中喹乙醇代谢物—3-甲基喹噁啉-2-羧酸，和卡巴氧代谢物—喹噁啉-2-羧酸的固相萃取-气相色谱质谱联用检测法。样品经偏磷酸甲醇水解，乙酸乙酯萃取和磷酸盐缓冲液反萃取，用混合阴离子交换SPE柱净化后，洗脱液氮气吹干， N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛衍生，衍生产物直接进气相色谱质谱联用仪检测。通过对猪肉、鸡肉和鸡蛋的添加回收试验，考察了方法的准确度、精密度和基质适应性。结果显示：目标分析物分别在0.5～5μg/kg质量浓度范围内呈良好线性，相关系数不低于0.9985；方法回收率达到87%～107%，相对标准偏差均小于15%；3-甲基喹噁啉-2-羧酸的检出限达到0.5μg/kg，甲基喹噁啉-2-羧酸的检出限达到0.2ug/kg；方法基质适应性良好。

关键词：喹乙醇代谢物；3-甲基喹噁啉-2-羧酸；卡巴氧代谢物；喹噁啉-2-羧酸；甲酯化衍生；固相萃取；气相色谱质谱联用

喹噁啉类兽药包括卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮等品种。卡巴氧、喹乙醇曾作为抗菌促生长剂在养殖业中都得到广泛的应用。根据JECFA报告中对卡巴氧和喹乙醇的风险评估，不仅二者本身具有潜在的致畸变、致癌作用，其代谢物也可能带来健康风险[1-2]。因此许多国家将卡巴氧和喹乙醇列为对食用动物禁用或限用的药物，毒理实验研究表明，喹噁啉类兽药具光敏毒性、致畸性和致癌性[1]，欧盟已于1998年禁止其应用于可食性动物[2]，中国兽药典(2005)明确规定，禁止在家禽及水产养殖中使用喹乙醇，但仍允许使用喹乙醇作为猪饲料添加剂。在动物体内，卡巴氧和喹乙醇经脱单氧、脱双氧后主要生成喹噁啉2-羧酸(QCA)或3-甲基喹噁啉2-羧酸(MQCA)[5,11]。由于二者的原药在动物组织内代谢迅速(代谢途径见图1)，而相应的代谢产物喹噁啉-2-羧酸(QCA)和3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)则相对稳定，因此通常将这两个代谢产物作为残留分析和监控的目标物。1995年联合国粮农组织(FAO)/世界卫生组织(WHO)食品添加剂联合专家委员会(JECFA)将3-甲基喹噁啉2-羧酸(MQCA)规定为喹乙醇在动物组织中的残留标识物[3]。2003年我国农业部规定了肌肉和肝脏组织中MQCA的最大残留限量分别为4μg/kg和50μg/kg。

文献报道的喹噁啉类药物残留代谢物的检测方法包括高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法和气质联用法。以往的喹噁啉类兽药残留检测要么为单残留检测方法，要么检测限较高、操作复杂、耗时冗长。因此，有必要建立可靠、灵敏、高效的色谱质谱联用多残留检测方法，同时监测各种喹噁啉类兽药残留，保障动物性食品的安全。

图1卡巴氧和喹乙醇在动物体内的代谢产物

Fig. 1Metabolitesofcarbadox andolaquindox inanimal tissues

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料：Agilent 7890A/5975C气相色谱质谱联用仪；3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）、喹噁啉-2-羧酸（QCA）购自Dr.E公司，甲醇、乙腈（色谱级）购自Merck公司，衍生试剂N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛购自TCA公司，其它试剂均为分析纯。

1.2 样品前处理方法：参照《GB/T 21322-2007 动物源食品中3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留的测定高效液相色谱法》的规定进行样品前处理，洗脱液氮吹至干后，加200μL乙腈和100μL N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛，漩涡混匀，80℃衍生反应30min，上gc/MS检测。

1.3 gc/MS检测条件：色谱柱：DB-5MS石英毛细管柱（30m x 0.25 mm x0.25 μm）；进样口温度：250℃；载气：氦气(99.999％)；流量：1.0mL/min；进样量：1.0μL；不分流进样；升温程序：70℃保持1 min，以10℃/min升至250℃ ，再以20℃/min升至290℃，保持6min。

EI源（250℃），电子能量70ev，传输线温度280℃，全扫描范围50～550m/z。选择离子监测，3-甲基-喹噁啉-2-羧酸SIM监测离子202.0、172.0、144.0、102.0；喹噁啉-2-羧酸SIM监测离子188.0、158.0、130.1、102.0。

2 结果与分析

2.1衍生方法的选择确定

MQCA和QCA属于羧酸类化合物，为实现对其gc/MS同时检测，最初尝试使用硅烷化衍生方法，但由于MQCA和QCA的化学结构极为相似（MQCA比QCA多一个甲基），硅烷化衍生基团较大，且与甲基位置邻近，导致两者的衍生产物在色谱上无法完全分开，故尝试采用甲酯化衍生。常用衍生羧酸的甲酯化衍生试剂包括重氮甲烷和三氟化硼甲醇等，这些试剂具有毒性大、易爆炸、衍生反应条件苛刻等特性，不适用于实验室常规操作。本研究采用N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛作为甲酯化衍生试剂，对MQCA和QCA进行衍生，通过对衍生温度、衍生时间、衍生剂用量的优化，结果表明，使用这一试剂可以在较简单的条件下较短的时间内完成衍生操作。

2.2 方法准确度和精密度

在猪肉中中添加MQCA和QCA进行添加回收率测定、考察方法的准确度和精密度。根据其最大限量要求，设置添加水平，MQCA的添加质量分数为1.0、4.0、8.0μg/kg，方法平均回收率为78.5%、85.0%、80.1%，变异系数为5.2%-7.75%；QCA添加质量分数为1.0、4.0、8.0μg/kg，方法平均回收率为80.8%、84.9% 、91.2%，变异系数为6.18%-8.28%。检出限0.5μg/kg。表明该方法的精密度良好，准确度能满足分析的需要。图1为空白样品TIC色谱图和添加了4.0μg/kg标准品的基质标准TIC色谱图。MQCA保留时间为12.87min， QCA保留时间为13.30min。

图1 A：空白猪肉样品TIC色谱图；B：空白猪肉加标4.0μg/kgTIC色谱图

3 结论

本文首次使用新型甲酯化衍生试剂N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛，建立了可以同时检测动物源性食品中喹乙醇代谢物—3-甲基喹噁啉-2-羧酸，和卡巴氧代谢物—喹噁啉-2-羧酸的固相萃取-衍生气相色谱质谱联用检测法。方法检出限低，回收率高，稳定性好，适用于动物源性食品中喹噁啉类兽药残留的检测。

参考文献

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