主题：【第六届原创】金莲花中牡荆苷的抗氧化作用研究

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feixiang168

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发表于：2013/12/21 20:01:27 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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金莲花中牡荆苷的抗氧化作用研究

概述

金莲花又称旱金莲（Trolliuschinensis Bunge）,为毛茛科植物金莲花的干燥花及花

蕾。金莲花属植物约有32种,主要分布于北半球温带及寒温带山区,其中我国约

有16种,分布于河北、山西、内蒙和东北等地区,其中以河北省承德地区所产的药材黄

酮含量为最佳。据记载中药金莲花功能为清热解毒，金莲花始载于清代赵学敏所著

《本草纲目拾遗》中谓其“味苦、性寒、无毒”。可“治口症、喉肿、牙宣、耳痛、

明目、解岚瘴”。野生金莲花资源丰富,广泛用于治疗呼吸道和肠道等疾病。在民间作

为清热解毒药,研究发现金莲花含有生物碱，挥发油，有机酸，总黄酮等多种有效成

分，牡荆苷为黄酮类化合物。现代药理研究表明金莲花中主要有效成分单体牡荆

苷(Vitexin)和荭草苷(Orientin)具有明显的抑菌活性。

关于金莲花中黄酮类化合物抗氧化作用的报道较少，为进一步探讨其抗氧化作用的机

制,我们对牡荆苷的抗氧自由基作用进行了体外实验并与VitC相比较。

目的：研究金莲花中牡荆苷的体外抗氧化作用。

方法：采用邻苯三酚自氧化法产生超氧阴离子自由基O^-₂^.,采用H₂O₂/Fe²⁺体系通过Fenton反应产生羟基自由基·OH,用分光光度法分别测定不同浓度的金莲花中牡荆苷对超氧阴离子自由基O^-₂^.和羟基自由基·OH的清除作用。

结果与讨论:

金莲花中牡荆苷具有清除邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子自由基O^-₂^.的作用,其50%清除率IC₅₀值为8.0ug^.ml^-1；而对于清除Fenton反应产生的羟基自由基OH作用则不显著。

金莲花中牡荆苷具有清除超氧阴离子自由基O^-₂^.的能力,这种能力在一定范围内随着牡荆苷的浓度的升高而增强，而Fenton反应产生羟基自由基·OH用于测定金莲花中牡荆苷的抗氧化作用则不显著。

1. 仪器、药品与试剂

1.1 仪器

紫外可见分光光度计（瓦里安）

十万分之一电子天平（德国）

KQ -500B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）

SZ-97自动三重纯水蒸馏器

SHH.W21.420型三用电热恒温水箱

1.2 药品与试剂

牡荆苷标准品，纯度≥98%（天津一方科技有限公司）

抗坏血酸（天津市化学试剂厂）

邻二氮菲，邻苯三酚，Tris，硫酸亚铁，30%过氧化氢，焦性没食子酸，磷酸二氢钾，盐酸，无水乙醇，无水甲醇，氢氧化钠，所用试剂均为分析纯。

实验用水为三重蒸馏水

2 方法

2.1 超氧阴离子自由基O^-₂^.的生成及其清除率的测定

采用邻苯三酚自氧化法产生超氧阴离子自由基O^-₂^.,当反应体系中存在超氧阴离子自由基O^-₂^.清除剂时,可使邻苯三酚自氧化产物在λ = 322nm处的吸收峰降低。通过加样品管A₃₂₂与对照管A₃₂₂的比较, 按下式计算药物对超氧阴离子自由基O^-₂^.的清除率。

清除率（%）=（A_标准-A_样品）÷A_标准×100%

实验时,在pH8.2的50 mmol·L^-1Tris-HCl缓冲液中依次加入药物(标准管不加药)及3 mmol·L^-1邻苯三酚,反应液总体积为10 ml,反应温度为25℃。反应启动,3分钟后加入1滴10 mol·L^-1的HCL终止反应，于λ = 322nm处测定其吸光度。以相应浓度的VitC溶液作为阳性对照。

2.2羟基自由基·OH的生成及清除率测定

H₂O₂/Fe²⁺体系可通过Fenton反应产生羟基自由基·OH:Fe²⁺+H₂O₂→Fe³⁺+OH^-+·OH。邻二氮菲-Fe²⁺在536nm波长有最大吸收,羟基自由基·OH将邻二氮菲-Fe²⁺氧化为邻二氮菲-Fe³⁺后,A₅₃₆明显降低。当反应体系中存在羟基自由基·OH清除剂时,此氧化过程受抑制,A₅₃₆则降低不明显。通过A₅₃₆值比较不同浓度药物对羟基自由基·OH的清除能力。按下式计算其清除率:

清除率(%)=(A_样品-A_标准)÷(A_空白- A_标准)×100%

实验过程中在各管中依次加入pH7.4的PBS缓冲液、不同浓度的药物、5mmol·L^-1 Fe²⁺溶液、0.3%H₂O₂及5 mmol·L^-1邻二氮菲溶液,反应液总体积为10 ml,37℃保温60 min,测各管A₅₃₆。以相应浓度的VitC溶液作为阳性对照。各加药管以加药不加H₂O₂及Fe²⁺作参比。空白管及标准管不加药,样品管加H₂O₂,空白管不加H₂O₂。

2.3 统计学处理数据以

±S表示，采用t检验。

结果

3.1 超氧阴离子自由基O^-₂^.的生成及其清除率的测定

结果见表1。

结果表明，牡荆苷、VitC在终浓度为0.5~10.0μg·ml^-1范围内，对于超氧阴离子的生成均有较强清除作用，且在此范围内，随着其浓度增加，清除作用逐渐增强。牡荆苷的IC₅₀值为8 .0ug^.ml^-1, VitC的IC₅₀值为3.7 ug^.ml^-1，其清除O^-₂^.作用弱于VitC。

3.2 羟基自由基·OH的生成及清除率测定

结果见表2。

由表2数据可知，牡荆苷仅在终浓度为2.0μg·ml^-1时出现了清除率，随着浓度的增加其吸光度值却在减小，出现了负清除率，因此进行了低于2.0μg·ml^-1范围内实验，结果见表3

由表2数据可知，VitC在终浓度为0.0~12.0μg·ml^-1范围内，对于羟基自由基·OH的生成有清除作用，且随着浓度的升高，其清除作用呈上升趋势；由表3数据可知，在0.0~1.0μg·ml^-1范围内随着牡荆苷浓度增加，其对羟基自由基·OH的清除作用逐渐增大：当浓度达到1.0μg·ml^-1时，清除作用达到最大，清除率为20.91%，后随着牡荆苷浓度增大，清除作用反而下降,当终浓度高于1.0μg·ml^-1时其清除作用渐渐消失。

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