中文摘要：目的 利用近红外光谱分析技术，建立原液中总蛋白及纤原含量的检测模型，实现原液的快速检定。方法选取层析过程流穿液为研究对象，收集流穿液制备了一系列不同浓度的样品，共60个，用透射模块采集其近红外光谱。建模过程中，首先用K-S方法将样品划分为40个校正集和20个验证集，简历模型，用R²、RMSEC、RMSECV、RMSEP对模型进行评价。结果建立模型的各项参数为：R²=0.995，RMSEC=0.1911，RMSECV=0.2245，RMSEP=0.1662。结论所建立的方法，可以快速准确的对层析流穿液的蛋白含量进行在线检测，如果应用于生产，还可以对层析过程进行饱和度分析，确定最优的层析方案。
关键词：近红外光谱分析；人纤维蛋白原；层析流穿液；蛋白质含量
人纤维蛋白原（HumanFibrinogen，Fg）是血浆的主要成分，含量高达2~4 g/L。在人凝血反应的最后阶段在凝血酶与人凝血因子ⅩⅢ、Ca²⁺作用下形成纤维蛋白凝胶，将血液有形成分包绕其中，达到止血的目的。在纤维蛋白原的生产过程中，通过层析收集流穿液进行下一步的制备。当离子交换树脂吸附饱和时停止收集，目前填料饱和度的判断通过检测流穿液中纤原的纯度来进行，采用凯氏定氮法分别检测原液中总蛋白的含量，进而计算得出。在制药领域，NIRS作为一种重要的PAT工具，已成功用于药物的原辅料质量评价、关键过程的监测和控制、成品的快速放行和质量检测等各个环节，为保证产品质量、降低生产成本、革新生产过程发挥了重要的作用。利用近红外光谱分析技术，建立原液中总蛋白及纤原含量的检测模型，可以实现原液的快速检定以及在线监测，提高生产效率。
1实验材料与仪器
1.1试剂
纤维蛋白原层析流穿液（山东泰邦生物制品有限公司，批号201409S05，蛋白含量9.70mg/mL）；注射用水。
1.2仪器
Antaris Ⅱ傅里叶变换近红外光谱仪（美国Thermo Fisher scientific公司），附件配置：透射检测器，1mm光程玻璃比色皿；Result光谱采集软件；Matlab 2009化学计量学软件（美国Mathworks公司）。
2方法
2.1样品制备
在纤原的生产过程中，对层析时的流穿液留样。按照不同的比例用注射用水将流穿液稀释，得到含有不同蛋白含量的样品共60个。
2.2近红外光谱采集
每个样品取适量装于光程4mm的比色皿中，采集其透射光谱，扫描范围为10000-4000cm^-1，分辨率为8 cm^-1，扫描次数32次，每小时扫描一次背景。
2.3校正集和验证集的划分
采用K-S分类的方法将样品划分为校正集和验证集，二者的比例为2:1，得到40个校正集样品和20个验证集样品。
2.4预处理方法的选择
本研究考察了Autoscale、均值中心化、一阶导数，以及两种方法联用等预处理方法对光谱数据进行处理后，对建模结果的影响，并以此选择最佳的预处理方法。
2.5光谱区间的选择
本研究中分别采用iPLS和GA筛选光谱变量，使用选择的谱区建立PLS模型，并依据模型结果的优劣确定最终使用的变量选择方法，从而更好地提高模型的性能。
2.6重复性考察
随机挑选3个验证集样品，每个样品重复测定10次光谱，用所建立的定量模型预测其蛋白含量，计算每个样品预测值的平均值和标准偏差。用χ²检验考察这些重复性标准偏差是否属于同一总体，若属于，则近红外方法的重复性按z×

×σ算出。
3.结果
3.1样品蛋白含量的分布
共制备60个样品，其蛋白含量范围在0.2425 mg·mL^-1~9.7000 mg·mL^-1，且分布较为均匀。
3.2样品的近红外光谱
采集的60个样品的原始透射光谱如图1所示。

图1 样品的原始近红外光谱图

3.3样品校正集和验证集划分结果
采用K-S分类方法将样品进行划分，选择40个样品作为校正集，20个样品作为验证集。如图2所示，样品均匀的分布在主成分空间中，其中灰色的点代表校正集样品，红色的点代表验证集的样品，验证集样品较为均匀的分布在校正集样品之中，满足划分的要求。

图2 样品集PC1&PC2得分图

3.4预处理方法的选择结果
分别采用Autoscale、均值中心化、一阶导数、Autoscale+一阶导数和均值中心化+一阶导数的方法对光谱数据进行预处理，然后建立PLS定量模型。用不同预处理方法处理后的光谱数据建模所得的模型参数如表1所示，通过对比发现，光谱经过Autoscale处理后，所建立的模型各项参数都是最好的，R²=0.994，RMSEC=0.1495，RMSECV=0.5671，RMSEP=0.3016，所以确定Autoscale为最佳的预处理方法。图3为用此法预处理后的光谱数据在全波段建立的PLS模型。

表1 不同预处理方法对建模的影响

预处理方法	R²	RMSEC	RMSECV	RMSEP	PCs
原始光谱	0.957	0.4892	0.6743	0.6945	6
Autoscale	0.994	0.1495	0.5671	0.3016	7
均值中心化	0.977	0.3227	0.5040	0.5573	6
一阶导数	0.974	0.1630	1.0915	0.7619	8
Autoscale+一阶导数	0.941	0.2682	1.2523	1.1317	6
均值中心化+一阶导数	0.967	0.1950	1.3558	0.8358	7

图3 Autoscale预处理全光谱建模结果图

3.5光谱区间选择结果
本研究分别采用iPLS和GA两种变量选择方法对光谱区间进行优选，通过对比模型参数的优劣确定最终使用的方法。
3.5.1Forward iPLS选择结果
采用Forward iPLS方法选择光谱区间，每个间隔宽度为100个变量，一个15个间隔，然后用每个间隔进行PLS模型的建立，根据每个子区间得到的RMSECV值选择一个或多个间隔用于最终PLS定量分析模型的建立。最终选择的结果如图4所示，绿色部分代表最终选择用来建模的区间，红色部分为没有参与建模的区间。图5显示了用选择的光谱区间进行建模的结果，模型的决定系数为0.995，RMSEC=0.1911，RMSECV=0.2245，RMSEP=0.1662，除RMSEC外各项参数都有一定程度的改善。

图4 Forward iPLS选择波段图

图5 iPLS选择光谱区间建模结果图

3.5.2Reverse iPLS选择结果
采用ReverseiPLS方法选择光谱区间。与ForwardiPLS方法类似，每个间隔宽度为100个变量，一共15个间隔，然后用每个间隔进行PLS模型的建立，根据每个子区间得到的RMSECV值选择一个或多个间隔用于最终PLS定量分析模型的建立。最终选择的结果如图6所示，绿色部分代表最终选择用来建模的区间，红色部分为没有参与建模的区间。图7显示了用选择的光谱区间进行建模的结果，模型的决定系数为0.995，RMSEC=0.1926，RMSECV=0.2475，RMSEP=0.1995，与Forward iPLS一样，除RMSEC略微上升外，各项参数较全光谱建模都有了改善。

图6 Reverse iPLS选择波段图

图7 iPLS选择光谱区间建模结果图

3.5.3GA变量选择结果

图8所示GA选择光谱区间结果图，图中颜色由红变蓝表示模型的RMSECV值逐渐变小。彩色部分为通过计算筛选出来的光谱区间，空白部分则予以剔除，建模结果如图9所示，决定系数为0.994，RMSEC=0.1620，RMSECV=0.3178，RMSEP=0.2577，模型的性能较全光谱建模也得到了一定程度的改善。

图8 GA变量选择结果图

图9 GA选择光谱区间建模结果图

3.5.4小结
通过采用两种iPLS和GA对用于建模的光谱变量进行筛选，将不同方法所建立的PLS模型的结果列于表2。可以发现，用每种方法筛选出来的变量建立模型，得到的结果都有一定程度的改善，虽然RMSEC有小幅上升，但是更为关键的参数RMSECV和RMSEP都有较为明显的下降，最终选择结果更好的ForwardiPLS方法。

表2 不同变量筛选方法比较

波段选择方法	R²	RMSEC	RMSECV	RMSEP	PCs
无	0.994	0.1495	0.5671	0.3016	7
Forward iPLS	0.995	0.1911	0.2245	0.1662	5
Reverse iPLS	0.995	0.1926	0.2475	0.1995	4
GA	0.994	0.1620	0.3178	0.2577	7

3.6重复性试验结果
在验证集样品中选取9号、22号和38号，每个样品重复测定10次光谱，用建立的模型对其蛋白含量进行预测，预测和统计结果列于表3。

表3 重复性结果

预测值测量次数	9号（mg·mL^-1）	22号（mg·mL^-1）	38号（mg·mL^-1）
1	5.8178	8.9833	1.2343
2	5.8045	8.9654	1.2145
3	5.8142	8.9765	1.2234
4	5.8345	8.9876	1.2487
5	5.8277	8.9732	1.2178
6	5.8139	8.9643	1.2289
7	5.8098	8.9677	1.2308
8	5.8345	8.9822	1.2199
9	5.8401	8.9734	1.2308
10	5.8320	8.9613	1.2214
平均值	5.8229	8.97349	1.22705
标准偏差	0.012	0.009	0.010
χ²	1.06
重复性	z××σ=0.044

对于给定95%置信水平，χ²_（_0.05,2_）临界值=5.99，所得的χ²值小于5.99，说明重复测定的所有方差属于同一总体，近红外方法测定样品纤原含量的重复性可按z×

×σ计算得出，为0.044。
4讨论
本实验采用近红外光谱分析技术，建立了纤维蛋白原生产的层析过程中，对流穿液中蛋白含量进行快速检测的PLS定量模型，可快速准确地预测流穿液中总蛋白的含量，证明了用近红外方法在线检测流穿液中纤原纯度的可行性。在研究过程中，首先制备了一系列不同浓度的样品，共60个，用透射模块采集其近红外光谱。建模过程中，首先用K-S方法将样品划分为40个校正集和20个验证集，然后确立了Autoscale作为光谱的预处理方法，最后通过考察，选择Forward iPLS方法进行光谱变量的筛选，最终建立的模型的各项参数为：R²=0.995，RMSEC=0.1911，RMSECV=0.2245，RMSEP=0.1662。
参考文献
倪道明. 血液制品 (第三版) . 北京: 人民卫生出版社, 2013.
马会利, 冯军, 陈纪林等. 人纤维蛋白原结构和功能研究进展. 四川生理科学杂志, 2002, 24(2): 53-7.
VELIK-SALCHNER C, HAAS T, INNERHOFER P, et al.The effect of fibrinogen concentrate on thrombocytopenia . Journal ofthrombosis and haemostasis : JTH, 2007, 5(5): 1019-25.
何英武,吴瑞玲.血浆纤维蛋白原测定的方法进展及临床意义. 现代中西医结合杂志,2004, 13(18): 2511-2.
Li L, DingB, Yang Q, et al. The relevance study of effective information between nearinfrared spectroscopy and chondroitin sulfate in ethanol precipitation process. J Innov Opt Heal Sci, 2014,07(06): 1450022.
Wang P, ZhangH, Yang H, et al. Rapid determination of major bioactive isoflavonoid compoundsduring the extraction process of kudzu (Pueraria lobata) by near-infraredtransmission spectroscopy .Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 2015, 137: 1403-1408.

Zhang XB, Feng YC, Hu CQ. Feasibility andextension of universal quantitative models for moisture content determinationin beta-lactam powder injections by near-infrared spectroscopy . Anal Chim Acta, 2008, 630(2): 131-140.