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一、前言
随着键合技术的发展,越来越多的填料适合于结构异构体的分离。
针对极性化合物的异构体分离,我们可以选择含卤素的键合相,比如常见的PFP或者F-C8
针对非极性化合物的异构体分离,我们可以选择多层键合的键合相,比如常见的PAH或者C30。
本文以我们实验室制备分离纯化的一个样品为例,简单探讨一下制备分离纯化的过程,欢迎小伙伴们一起探讨学习,共同提高。
二、填料筛选
客户样品是脂溶性油状物,并且存在着难以分离的结构异构体,我们选择三款键合相不同的色谱柱Welch Ultimate XB-C18(单层键合),Welch UltimatePAH(多层键合),Welch Ultimate XB-C30(多层键合)对目标物质进行分离。使用客户的分析条件(表1),进样20uL。
表1 填料筛选条件
色谱柱 | Welch UltimateRXB-C18,10um,4.6*250mm; Welch UltimateRPAH,10um,4.6*250mm; Welch UltimateRXB-C30,10um,4.6*250mm |
流动相 | 甲醇:乙腈=70:30 |
流速 | 1mL/min |
检测波长 | 254nm |
样品 | 称量样品1.0mg,使用流动相1mL溶解样品,过滤。 |
上样体积 | 20uL |
由于考虑到后期规模化制备,因此填料筛选时使用10um粒径的填料进行。谱图如下:
a、XB-C18谱图
b、PAH谱图
c、XB-C30谱图从上面的谱图明显看出,Welch Ultimate XB-C18,Welch Ultimate PAH对分离的影响不大,但是Welch Ultimate XB-C30较其他两种填料多分出一个峰,表明Welch Ultimate XB-C30更适合于这个混合物的分离。因此,固定制备条件(表2)。
表2 制备条件
色谱柱 | Welch UltimateRXB-C30,10um,4.6*250mm |
流动相 | 甲醇:乙腈=70:30 |
流速 | 1mL/min |
检测波长 | 254nm |
上样体积 | 20uL |
同时,在后续的纯度检测中,使用我们也同样使用Welch Ultimate XB-C30,5um,4.6*250mm取代Welch Ultimate XB-C18,5um,4.6*250mm对样品的纯度检测分析。
表3 分析条件
色谱柱 | Welch UltimateRXB-C30,5um,4.6*250mm |
流动相 | 甲醇:乙腈=70:30 |
流速 | 1mL/min |
检测波长 | 254nm |
上样体积 | 20uL |
四、使用制备柱对样品进行制备分离
使用丙酮溶解样品,浓度为30mg/mL,使用Welch Ultimate XB-C30,10um,30*250mm ,根据上样量与色谱柱的内径平方成正比计算得到30mm内径的制备柱上样量大约在4ml,流速40ml/min。经过微调,将流速降低到30ml/min。谱图如下:
分段收集:49-59min,59-69min,69-96min,96-100min,100-104min。分别标记为b1、b2、b3、b4、b5。
对收集后的样品进行分析测试
分段收集后,使用分析条件对收集的样品进行纯度分析。
b1号样品 目标峰纯度:97.6%
b2号样品 目标峰纯度:98.5%
b3号样品 目标峰纯度:98%
b4号样品 目标峰纯度:94.2%
b5号样品 目标峰纯度:87%
五、结论
使用丙酮溶解样品,浓度为30mg/mL,一次上样4mL,具体条件如下:
色谱柱 | Welch UltimateRXB-C30,10um,30*250mm |
流动相 | 甲醇:乙腈=70:30 |
流速 | 30mL/min |
检测波长 | 254nm |
上样量 | 120mg |
纯度及回收率如下表,符合客户要求: