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主题：【分享】相关物质检测方法验证方案

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东风恶

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发表于：2012/07/30 14:45:41 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1. 验证目的

2. 验证范围

3. 验证依据

4. 验证时间

5. 验证内容

5.1 仪器配置

5.2 验证所使用的试剂及标准品

5.3 验证可接受标准

5.4 需验证的测试方法

5.5 系统适应性实验

5.6 方法专属性

5.7 系统精密度

5.8 最小检测限

5.9 最小定量限

5.10 验证范围

5.11 方法精密度

5.12 线性范围

5.13 方法准确度

5.14 方法中间精密度

5.15 方法耐用性

6. 结果分析、结论及评价

7. 附件

1. 验证目的

确保--------相关物质检测方法准确、重现并耐用，为建立检验操作程序提供依据。

2. 验证范围

--------相关物质检测方法方法学验证。

3. 验证依据

ICH指南12.8（Validation of Analytical procedure）；

USP25版（1225）（Validation of Compendial Methods）。

4. 验证时间

2003年月日起至2003年月日

5. 验证内容

5.1 仪器配置

名称		型号	序列号	供应商	校验日期	校验结论	有效时间
高效液相色谱	进样器
	泵
	检测器
	色谱工作站
色谱柱

5.2 验证所使用的试剂与标准品

名称	规格

5.3 验证可接受标准

项目		指标
系统适应性实验	--------与相邻峰的分离度	大于1.5
	--------峰的拖尾因子	小于1.4
	--------峰的理论塔板数	大于5000
	--------峰峰面积相对标准偏差(系统精密度)	小于1%
方法专属性	稀释剂空白实验	不干扰样品测试
	主要原料加入实验	不干扰样品测试、--------峰峰纯度大于990
	降解实验	不干扰样品测试，与--------峰分离度大于1.5 --------峰峰纯度大于990
系统精密度(相对标准偏差)		小于1%
最小检测限测试		符合S/N=3±1的要求
最小定量限测试		符合S/N=10±1的要求
验证范围内的方法精密度(相对标准偏差)		小于5%
验证范围内的线性范围测定		相关系数大于0.999
验证范围内的方法准确度(相对标准偏差)		小于5%
方法中间精密度(相对标准偏差)		同一样品连续3天测试RSD小于5%
方法耐用性（与含量方法学验证相同）		相邻峰分离度大于1.5

5.4 需验证的测试方法

5.4.1 实验条件

-------液相色谱仪

检测器：二极管阵列紫外检测器（DAD）检测波长：295nm

流速：0.6mL/min 进样量：10μL

色谱柱： -

5.4.2 溶液的配制

1. 流动相的配制

1.1 磷酸盐缓冲溶液的配制

称取0.45g磷酸二氢钾，加入500mL水溶解，再加入0.5mL二甲基辛胺后用磷酸调节溶液pH值至3.0，混匀即得磷酸盐缓冲液。

1.2 流动相配制

按磷酸盐缓冲液：四氢呋喃（975：25）比例混合，再用0.45μm的滤膜过滤，脱气即可。

2. 样品溶液的配制

称取--------标准品约50mg，精密称定，置25mL容量瓶中，用流动相溶解稀释至刻度，混匀即得。

3. 对照溶液的配制

精密移取样品溶液1mL，置100mL容量瓶中，用流动相溶解稀释至刻度，混匀即得对照溶液。

4. 测定方法

分别将样品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录样品溶液图谱时间为--------峰保留时间的3倍，计算样品中--------的相关物质含量。

相关物质%= R_H / R_L

式中：R_H---为样品溶液中各相关物质的峰响应值；

R_L---为对照溶液中--------的峰响应值；

5.5 系统适应性实验（图谱见附图1）

5.5.1 操作步骤

1. 配制--------样品溶液，进样，计算--------峰与相邻峰之间的分离度。

2. 按相关物质测定方法中对照品溶液的制备方法,制备约0.02mg/mL的--------标准品溶液，连续等体积（约10μL）进样6次，得到--------峰响应值，计算峰面积的RSD%，拖尾因子及理论塔板数。

表1. 系统适应性实验数据

进样次数	保留时间（min）	峰面积（mAU^*s）
1
2
3
4
5
6
平均值
RSD%
--------峰与相邻峰之间的分离度
--------主峰的拖尾因子
--------主峰的理论塔板数

5.5.2 结果

样品溶液色谱图中，--------与相邻峰之间的分离度为2.11。

标准品溶液图谱中，--------的峰面积的RSD%为0.5%，拖尾因子为1.275，理论塔板数为6414，均符合标准要求。

5.6. 方法专属性（图谱见附图2及附图3）

5.6.1 操作步骤

1. 单独进样样品稀释剂溶液，即流动相溶液。

2. 配制--------样品溶液进样，确定保留时间并检查峰纯度。

3. 在--------样品溶液中加入主要原料吲唑酸、甲胺，进样，检查--------峰纯度。

4. 测试经光照,酸，碱，氧化，还原，热解，水解的降解所得的反应液，确认所有降解物质对--------的测试无干扰，并测定主峰纯度，以确认--------主峰中无潜在的降解产物干扰。

表2. 方法专属性测试结果-原料

样品	样品溶液	加入原料后的样品溶液
保留时间	9.054	9.301
峰纯度	999.3	999.1

表3. 方法专属性测试结果-降解（一）

降解类型	正常	酸	碱	氧化	还原	水解
降解类型	正常	酸	碱	氧化	还原	24小时	48小时
降解杂质RRT及含量（%）（--------RRT=1）











总杂质（%）
--------峰面积（mAU*S）
与--------峰最近的主要降解杂质与--------之间的分离度
--------峰峰纯度

表4. 方法专属性测试结果-降解（二）

降解类型	光照				高温
降解类型	1天	3天	5天	10天	280℃	290℃	300℃	310℃
降解杂质RRT及含量%(--------RRT=1)






















总杂质（%）
--------峰面积（mAU*S）
与--------峰最近的主要降解杂质与--------之间的分离度
--------峰峰纯度

5.6.2 结果

稀释剂空白对样品测试无干扰。

主要原料不干扰--------测定,其主峰纯度为999.1。

所有降解产物不干扰--------测定,其与--------之间的分离度均大于1.5。

降解前后--------主峰纯度均大于990。

5.7 系统精密度（图谱见附图4）

5.7.1 操作步骤

按相关物质测定方法中对照品溶液的制备方法,制备约0.02mg/mL的--------标准品溶液，连续进样6次，每次10μL，记录色谱图。计算--------主峰保留时间及峰面积的RSD%。

表5. 系统精密度测试结果

进样次数	保留时间（min）	峰响应值(mAU*s)
1
2
3
4
5
6
平均值
RSD%

5.7.2 结果

--------主峰保留时间及峰面积的相对标准偏差（RSD%）均未超过1.0%，符合标准要求。

5.8 最小检测限测试（图谱见附图5）

5.8.1 操作步骤

准确配制标准溶液，逐级稀释至一定浓度并进样。计算其峰高与噪声的比值（信噪比），其信噪比（S/N=3±1）的样品浓度即为最小检测限浓度，其对应检出量即为最小检测限。

表6. 最小检测限数据

物质名称	浓度（mg/mL）	保留时间(min)	峰高	S/N	检测限（g）
--------

5.8.2 结果

满足信噪比S/N=3±1，--------检测限为1.0×10^-9g。

5.9 最小定量限测试（图谱见附图6）

5.9.1 操作步骤

准确配制被测物标准溶液，逐级稀释至一定浓度并进样，连续进样3次。计算其峰高与噪声的比值（信噪比），其信噪比（S/N=10±1）的样品浓度即为定量限浓度，其对应检出量即为定量限。

表7. 最小定量限数据

物质名称	浓度（mg/mL）	保留时间(min)	峰高	S/N	定量限（g）
--------

5.9.2 结果

满足信噪比S/N=10±1，--------的定量限为4.0×10^-9g。

5.10 验证范围的确认

根据杂质测试的具体要求及情况，确定验证范围为：

定量限～杂质标准120%，即4.0×10^-4 mg/mL～2.4×10^-2 mg/mL。

5.11 验证范围内的方法精密度（图谱见附图7）

5.11.1 操作步骤

1. 选择一批有代表性的药物主成分样品，按照相关物质测试方法制备相应的测试溶液，共单独配置6份。每个样品溶液测试2次，计算每个样品溶液中杂质的含量及平均值。

2. 计算6份溶液中杂质含量及相应的RSD%。

表8. 方法精密度测试结果

编号	样品浓度（mg/mL）	杂质1（%）	杂质2（%）	杂质3（%）	总杂质（%）
1
2
3
4
5
6
平均值
RSD%

5.11.2 结果

各杂质含量及总杂质含量结果的RSD%均小于5%，符合标准要求。

5.12 验证范围内的线性测定（图谱见附图8）

5.12.1 操作步骤

1. 称取--------标准品，在验证范围内选择合适间隔的5个浓度点（包括标准点、范围的最低点及最高点）。

2. 每个浓度点平行测定2次，记录色谱图，计算每个浓度点的峰面积平均值。

3. 以样品平均浓度对相应平均峰面积做回归曲线，计算回归方程及相应的线性回归系数。

表9. 线性测试结果

编号		1	2	3	4	5
浓度（mg/mL）		4.0×10^-4	2.0×10^-3	1.0×10^-2	2.0×10^-2	2.4×10^-2
峰面积（mAU^*s）	1	11.1750	57.1631	278.4095	559.6586	669.6836
峰面积（mAU^*s）	2	11.1343	55.6612	278.8550	558.7421	669.9570
平均值（mAU^*s）		11.1546	56.4122	278.6322	559.2004	669.8203
回归方程		y=27920.43298x＋8.45396×10^-2
相关系数		1.00000

5.12.2 结果

在4.0×10^-4～2.4×10^-2 mg/mL范围内，--------线性关系良好，相关系数为1.00000，大于0.999。

5.13 验证范围内的方法准确度（图谱见附图9）

5.13.1 操作步骤

1. 用一批有代表性的--------样品定量称样并配制成相对杂质标准为80%、100%、120%的三种测试溶液。每个浓度点配制3份。每个浓度点，每份溶液均应单独称样配制。

2. 计算每个浓度点的杂质含量及RSD%。

表10. 方法准确度测试数据

相对浓度	编号	杂质1	杂质2	杂质3	总杂质
80%	1	0.08269	0.01009	0.006468	0.09925
	2	0.08188	0.01016	0.006524	0.09856
	3	0.08060	0.01007	0.006979	0.09765
100%	1	0.07935	0.009713	0.006409	0.09547
	2	0.08722	0.009990	0.006526	0.1037
	3	0.08759	0.01032	0.006761	0.1047
120%	1	0.08330	0.009922	0.006162	0.09938
	2	0.08033	0.01009	0.006477	0.09690
	3	0.08052	0.009862	0.006495	0.09688
平均值		0.08261	0.009946	0.006533	0.09917
RSD（%）		3.6	3.2	3.5	3.1

5.13.2 结果

三个浓度点杂质含量结果的相对标准偏差均小于5%，符合标准要求。

5.14 方法中间精密度（图谱见附图10）

5.14 操作步骤

1. 使用3批不同批号的--------样品，按相关物质测试的要求准备相应的样品溶液和对照品溶液，按如下要求进行测试（每个样品2份，每份测定2次）。

2. 连续三天测试（样品与对照品溶液每天重新配制）。

3. 计算每批样品每天测试的相关物质平均含量以及3天测试相关物质含量结果的RSD%。

表11. 中间精密度测试结果（一）

GR-20030201V	杂质1	杂质2	杂质3	总杂质
月日
月日
月日
月日
月日
月日
平均值
RSD%

表12. 中间精密度测试结果（二）

GR-20030202V	杂质1	杂质2	杂质3	总杂质
月日
月日
月日
月日
月日
月日
平均值
RSD%

表13. 中间精密度测试结果（三）

GR-20030203V	杂质1	杂质2	杂质3	总杂质
月日
月日
月日
月日
月日
月日
平均值
RSD%

5.14.2 结果

同一批样品连续3天测试结果的相对标准偏差（RSD%）均小于5%，符合标准要求。

5.15 方法耐用性（图谱见附图11）

5.15.1 操作步骤

1. 溶液稳定性

1.1 配制--------样品溶液，按如下时间点测试。

时间点：0（初始点），2小时，4小时，8小时，24小时，48小时

1.2 用百分面积法测试并计算每个时间点--------相关物质与杂质结果及相应的变化，根据--------含量测定RSD在0.1%范围内来确定--------溶液的稳定性时间。

2. 色谱条件的变化

2.1 制备--------样品溶液。

2.2 分别使用正常流动相，预定测试的不同pH、不同有机相比例的流动相以及不同的柱流速，待仪器系统稳定后测试--------样品溶液。

2.3 记录相邻峰间的分离度。

表14. 溶液稳定性测试表

设定时间（小时）	杂质结果	主峰	含量
设定时间（小时）			含量
0
2
4
8
24
48
平均值
RSD%
由上可知：--------含量测试变化极小，可以确定其溶液在48小时内是稳定的。

表15. 色谱条件变化耐用性测试表

分

离

度

色

谱

条

件

杂质1

杂质2

--------主峰

杂质3

流动相pH值

流动相中有机相比例（%）

柱流速（mL/min）

5.15.2 结果

色谱条件有微小变化时，相邻杂质间及主峰与相邻杂质间分离度均大于1.5，符合标准要求。

6. 结果分析、结论及评价

系统适应性实验中，--------峰峰面积的RSD%为0.3%，主峰与相邻峰的分离度R为2.11，主峰拖尾因子为1.275，理论塔板数为6414。可知该系统用于--------相关物质检测方法学验证是可行的，测试结果具有很好的重现性。

该方法用于相关物质检测，在测试相对浓度为80%、100%、120%3个浓度点间相关物质测试结果的RSD%小于5%，在80%~120%相对浓度测试范围内线性相关系数为1.0， 3批样品连续3天测试结果相应的RSD均小于5.0%；当色谱条件发生微小变化时，所有相邻峰间分离度均大于1.5。由此可见，应用该方法进行--------的相关物质测定，具有选择性好，方法准确、精密，重现性好等优点，可以作为制定--------的相关物质检测标准操作规范的依据。

7. 附件

附图1. 系统适应性实验图谱

附图2. 方法专属性图谱1

附图3. 方法专属性图谱2

附图3-1. 氧化强制降解图谱

附图3-2. 还原强制降解图谱

附图3-3. 酸强制降解图谱

附图3-4. 碱强制降解图谱

附图3-5. 光照强制降解图谱

附图3-6. 水强制降解图谱

附图3-7. 高温强制降解图谱

附图4. 系统精密度图谱

附图5. 最小检测限图谱

附图6. 最小定量限图谱

附图7. 方法精密度图谱

附图8. 线性测定图谱

附图9. 方法准确度图谱

附图10. 方法中间精密度图谱

附图11. 方法耐用性图谱

4. 残留溶剂

根据ICH指南和USP25版的要求，我们对开发的--------残留溶剂检测方法进行了方法学验证。通过对建立的--------残留溶剂检测方法的考察，证明其选择性好、精密度高、线性关系良好、准确度高、最小检测限及最小定量限极低、耐用性高，从而证明此方法检测--------产品残留量是可行的，能够保证--------产品中残留溶剂被有效检出；并且，能作为制订--------残留溶剂质量标准和检测方法的依据。

相关验证报告，请参见附件7。

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有需要的朋友请复制后，其格式就变好了，一个很好的参考模板。

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2012/7/31 21:48:37 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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是的，谢谢您的关心，完整版本还有中英文对照的，这个只是我写的初稿，有些地方请斧正。

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2012/7/31 22:06:38 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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从你们的申报资料中摘抄出来的吗？

是的，谢谢您的关心，完整版本还有中英文对照的，这个只是我写的初稿，有些地方请斧正。

方法耐用性这一块，现在好像没有说一定要加上去。
当然，做了更好，特别能遇上耐用性好的色谱方法更好！

如果耐用性不好的话，也是无关紧要的。在检测方法中加一个系统适用性实验就ＯＫ了！

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2012/7/31 22:14:06 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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从你们的申报资料中摘抄出来的吗？

是的，谢谢您的关心，完整版本还有中英文对照的，这个只是我写的初稿，有些地方请斧正。

方法耐用性这一块，现在好像没有说一定要加上去。
当然，做了更好，特别能遇上耐用性好的色谱方法更好！

如果耐用性不好的话，也是无关紧要的。在检测方法中加一个系统适用性实验就ＯＫ了！

学习了，在交代色谱条件的时候特别把关键点列出来，如pH值的范围，离子浓度等。

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2012/7/31 22:33:47 6楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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从你们的申报资料中摘抄出来的吗？

是的，谢谢您的关心，完整版本还有中英文对照的，这个只是我写的初稿，有些地方请斧正。

方法耐用性这一块，现在好像没有说一定要加上去。
当然，做了更好，特别能遇上耐用性好的色谱方法更好！

如果耐用性不好的话，也是无关紧要的。在检测方法中加一个系统适用性实验就ＯＫ了！

学习了，在交代色谱条件的时候特别把关键点列出来，如pH值的范围，离子浓度等。

如果流动相中有离子对试剂、以及需要调节ｐＨ值，这些都是最关键点！

建议，如果有可以不用离子对试剂的方法，最好还是别用。
不光开发方法时难度大，以后真正检验时也是一个麻烦事儿。

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是的，谢谢您的关心，完整版本还有中英文对照的，这个只是我写的初稿，有些地方请斧正。

方法耐用性这一块，现在好像没有说一定要加上去。
当然，做了更好，特别能遇上耐用性好的色谱方法更好！

如果耐用性不好的话，也是无关紧要的。在检测方法中加一个系统适用性实验就ＯＫ了！

学习了，在交代色谱条件的时候特别把关键点列出来，如pH值的范围，离子浓度等。

如果流动相中有离子对试剂、以及需要调节ｐＨ值，这些都是最关键点！

建议，如果有可以不用离子对试剂的方法，最好还是别用。
不光开发方法时难度大，以后真正检验时也是一个麻烦事儿。

您不整点离子对，人家厂商如何活啊！目前，我用在阿莫西林的复方制剂，这样有关物质分离度好一些。

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2012/7/31 23:04:19 8楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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从你们的申报资料中摘抄出来的吗？

是的，谢谢您的关心，完整版本还有中英文对照的，这个只是我写的初稿，有些地方请斧正。

方法耐用性这一块，现在好像没有说一定要加上去。
当然，做了更好，特别能遇上耐用性好的色谱方法更好！

如果耐用性不好的话，也是无关紧要的。在检测方法中加一个系统适用性实验就ＯＫ了！

学习了，在交代色谱条件的时候特别把关键点列出来，如pH值的范围，离子浓度等。

如果流动相中有离子对试剂、以及需要调节ｐＨ值，这些都是最关键点！

建议，如果有可以不用离子对试剂的方法，最好还是别用。
不光开发方法时难度大，以后真正检验时也是一个麻烦事儿。

您不整点离子对，人家厂商如何活啊！目前，我用在阿莫西林的复方制剂，这样有关物质分离度好一些。