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主题：【原创】超高效液相色谱检测奶及奶制品中的M族黄曲霉毒素-增补版

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菜头
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发表于：2014/02/07 10:00:28 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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  超高效液相色谱检测奶及奶制品中的M族黄曲霉毒素




液相色谱条件

液相色谱仪：美国Waters Acquity超高效液相色谱仪配荧光检测器（带大体积流通池）

色谱柱：Welch Ultimate XB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速：0.3 mL/min ；柱温：40 ℃；进样量：10 μL；激发波长：360 nm；发射波长：420 nm；流动相： A：纯水；B：甲醇/乙腈（50+50）；梯度条件：0~4.0 min，30%B；4.2~4.7 min，100%B；5 min，30%B。



样品提取与净化

        液态奶样品, 称取10.0 g于50 mL离心管中, 加入25mL乙腈, 充分涡旋3 min后, 超声提取10 min, 8000r/min条件下离心5min, 取全部上清液旋蒸至10 mL以下, 全部转移至50 mL容量瓶中, 以PBS溶液定容至刻度。取25mL溶液过黄曲霉毒素M1免疫亲和柱, 以10mL PBS缓冲液淋洗柱子, 弃去全部流出液, 用5 mL甲醇洗脱免疫亲和柱, 收集全部洗脱液于玻璃试管中, 55 ℃下氮吹干, 用1.0 mL乙腈:水(20:80)溶液溶解残留物, 过0.22 μm滤膜, 收集滤液于进样瓶中, 供上机检测。过柱净化处理在自动固相萃取装置上进行。
        奶粉样品, 称取1.00 g样品, 加入10 mL水溶解。其余过程同液态奶样品。


波长选择

采用流动相作为背景溶液, 分别扫描黄曲霉毒素M1、M2的激发波长和发射波长(图2, 图3)。固定发射波长420nm, 激发波长从300 nm扫描到400 nm; 固定激发波长360 nm, 发射波长从390nm扫描到500 nm。结果表明黄曲霉毒素M1、M2的最佳激发波长为360nm, 最佳发射波长分别为420 nm和426 nm。黄曲霉毒素M1、M2的结构很相似, 因此波长也相差不多。考虑到简化检测条件, 因此取激发波长为360nm, 发射波长为420 nm。



线性范围与检出限

以0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ng/mL的黄曲霉毒素M1、M2混合标准溶液作校准曲线, 在给定条件下进行UPLC分析, 以峰面积为Y轴, 浓度为X轴做校准曲线。

分别取空白基质样品, 加入混合标准溶液, 经放置待加入的标准品与基质充分混合后, 按方法前处理, 根据3倍信噪比的峰响应值, 得出此方法检出限, 根据10倍信噪比, 得出线性范围的下限。结果见表1。



加标回收及精密度

实验中所用的免疫亲和柱为黄曲霉毒素M1免疫亲和柱, 为了验证该柱对黄曲霉毒素M2的适用性, 以稀释后的标准溶液过黄曲霉毒素M1免疫亲和柱, 3个平行, 回收率见表4。平均回收率均大于80%。
向空白牛奶样品中添加不同量的黄曲霉毒素M1、M2混合标准溶液, 每个添加量做3个平行, 计算黄曲霉毒素M1、M2的平均回收率及相对标准偏差, 结果见表2。取中等水平的添加样品做精密度(n=5)试验, 液态乳中黄曲霉毒素M1、M2的日内精密度(RSD)分别为2.7%、4.8%,乳粉中黄曲霉毒素M1、M2的日内精密度(RSD)分别为2.1%、4.5%。




实际样品测定

实验中对市售的50份牛奶及奶粉样品进行了检测, 其中黄曲霉毒素M1的检出率为80%, 发现奶粉超标样品2份。黄曲霉毒素M1的含量分别为 0.88 μg/kg和0.79μg/kg; 同时, 发现这两份奶粉样品同时含有黄曲霉毒素M2,含量分别为0.22 μg/kg和0.20μg/kg。阳性样品谱图见图3。

表1  黄曲霉毒素M1、M2检测方法的线性回归方程及相关系数



名称

线性范围(ng/mL)

回归方程

相关系数(R2)

检出限 (μg/kg)

黄曲霉毒素M1

 

Aflatoxin M1

0.1~5.0

Y=2.59E+004X+3.17E+002

0.9991

0.003

黄曲霉毒素M2

 

Aflatoxin M2

0.1~5.0

Y=2.26E+005X-1.26E+003

0.9997

0.003



表2  牛奶样品黄曲霉毒素M1、M2的加标回收率(n=3)



样品基质

添加量(μg/kg)

毒素种类

平均检测结果(μg/kg)

RSD/%

平均回收率(%)

溶剂

10.00

AFT M1

8.150

3.9

81.5

AFT M2

9.890

2.5

98.9

液态奶

0.05

AFT M1

0.502

2.0

100.4

AFT M2

0.532

3.7

106.4

0.20

AFT M1

0.175

3.2

87.5

AFT M2

0.172

2.2

86.0

1.00

AFT M1

0.845

1.8

84.5

AFT M2

0.856

2.4

85.6

奶粉

0.50

AFT M1

0.418

4.6

83.6

AFT M2

0.426

3.7

85.2

2.00

AFT M1

1.750

1.4

87.5

AFT M2

1.630

2.0

81.5

10.00

AFT M1

8.560

2.3

85.6

AFT M2

9.340

3.4

93.4



图2  黄曲霉毒素M1、M2激发波长扫描谱图





图3  黄曲霉毒素M1、M2发射波长扫描谱图





图3 黄曲霉毒素M1、M2样品谱图
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三人行
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2014/2/8 13:23:57 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
4分钟时峰都快跑完了，为何还要4.2~4.7 min100%B呢？
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dahua1981
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2014/2/8 13:41:54 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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4分钟时峰都快跑完了，为何还要4.2~4.7 min100%B呢？
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zhw19811005
zhw19811005
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2014/2/8 22:33:38 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
梯度条件是：0~4.0 min的啊
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菜头
laohutushen
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2014/2/10 9:31:10 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 三人行(jncxyy2012) 发表:

4分钟时峰都快跑完了，为何还要4.2~4.7 min100%B呢？


这个梯度条件是用另外一根柱子的时候确定下来的，后来换了月旭的柱子，也没更改。从出峰情况来看，是可以从3.3或3.5分钟后就切到100%的有机相冲洗了。

虽然在前面等度的时候能分开了，还是习惯用梯度条件冲洗一下，柱子能更干净些。
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三人行
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2014/2/10 9:42:01 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 菜头(laohutushen) 发表:
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4分钟时峰都快跑完了，为何还要4.2~4.7 min100%B呢？


这个梯度条件是用另外一根柱子的时候确定下来的，后来换了月旭的柱子，也没更改。从出峰情况来看，是可以从3.3或3.5分钟后就切到100%的有机相冲洗了。

虽然在前面等度的时候能分开了，还是习惯用梯度条件冲洗一下，柱子能更干净些。


不是这样的，没必要用100%的有机相冲洗，直接用30%B冲洗就好了。
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风尘2014
v2850895
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2014/2/10 11:24:56 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
有钱当然买新机器啦！
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wsy18
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2014/2/11 16:48:08 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 三人行(jncxyy2012) 发表:
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4分钟时峰都快跑完了，为何还要4.2~4.7 min100%B呢？


这个梯度条件是用另外一根柱子的时候确定下来的，后来换了月旭的柱子，也没更改。从出峰情况来看，是可以从3.3或3.5分钟后就切到100%的有机相冲洗了。

虽然在前面等度的时候能分开了，还是习惯用梯度条件冲洗一下，柱子能更干净些。


不是这样的，没必要用100%的有机相冲洗，直接用30%B冲洗就好了。


那样就用不着梯度了。
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三人行
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2014/2/11 17:04:02 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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4分钟时峰都快跑完了，为何还要4.2~4.7 min100%B呢？


这个梯度条件是用另外一根柱子的时候确定下来的，后来换了月旭的柱子，也没更改。从出峰情况来看，是可以从3.3或3.5分钟后就切到100%的有机相冲洗了。

虽然在前面等度的时候能分开了，还是习惯用梯度条件冲洗一下，柱子能更干净些。


不是这样的，没必要用100%的有机相冲洗，直接用30%B冲洗就好了。


那样就用不着梯度了。


根据你的条件和图谱，用等度就可以了。
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wsy18
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4分钟时峰都快跑完了，为何还要4.2~4.7 min100%B呢？


这个梯度条件是用另外一根柱子的时候确定下来的，后来换了月旭的柱子，也没更改。从出峰情况来看，是可以从3.3或3.5分钟后就切到100%的有机相冲洗了。

虽然在前面等度的时候能分开了，还是习惯用梯度条件冲洗一下，柱子能更干净些。


不是这样的，没必要用100%的有机相冲洗，直接用30%B冲洗就好了。


那样就用不着梯度了。


根据你的条件和图谱，用等度就可以了。
不是我的，是蔡老师的。
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三人行
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2014/2/11 17:11:38 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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4分钟时峰都快跑完了，为何还要4.2~4.7 min100%B呢？


这个梯度条件是用另外一根柱子的时候确定下来的，后来换了月旭的柱子，也没更改。从出峰情况来看，是可以从3.3或3.5分钟后就切到100%的有机相冲洗了。

虽然在前面等度的时候能分开了，还是习惯用梯度条件冲洗一下，柱子能更干净些。


不是这样的，没必要用100%的有机相冲洗，直接用30%B冲洗就好了。


那样就用不着梯度了。


根据你的条件和图谱，用等度就可以了。
不是我的，是蔡老师的。


你俩的头像一样，看混了。
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