客户提供了头孢氨苄工作对照品、杂质7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸、α-苯甘氨酸、△-2-头孢氨苄对照品和80℃条件下破解供试品溶液所得的分离度溶液。现要求本实验室选择合适的C₁₈色谱柱，实现头孢氨苄的有关物质分析。
在头孢氨苄有关物质分析中，流动相为高水相条件，故本实验室首先尝试使用能在高水相下稳定使用的高极性色谱柱CAPCELL PAK C₁₈AQ S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm（柱号：A6AD04229），对80℃破解所得分离度溶液进行分析，结果见图1。

图1 80℃破解溶液及空白溶液分析所得色谱图（C₁₈AQ色谱柱）

*注：峰上所标数字为分离度，下同。

如图1，头孢氨苄主峰保留时间为21.09min，主峰与前后杂质分离度分别为2.42和3.37，达到药典要求的基线分离。
进一步分析杂质对照品溶液和供试品溶液，如图2，杂质7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸（7-ADCA）和α-苯甘氨酸的分离度为11.19，符合药典要求。

图2 杂质对照品溶液分析所得色谱图（C₁₈ AQ色谱柱）

如图3，对供试品溶液进行分析，各杂质间分离度良好。

图3 头孢氨苄供试品溶液分析所得色谱图（C₁₈AQ色谱柱）

客户要求考察低浓度（10 μg/mL）下头孢氨苄与其异构体△-2-头孢氨苄的分离情况，在客户允许调整柱温（30℃~40℃）的前提下进行分析，如图4，当柱温设定为30℃时，头孢氨苄与△-2-头孢氨苄的分离度最佳，为1.17。

图4 头孢氨苄及△-2-头孢氨苄混合溶液分析所得色谱图（C₁₈ AQ色谱柱）

为使客户有更多色谱柱选择，本实验室又进一步尝试了资生堂中等极性色谱柱CAPCELL PAK C₁₈MGII以及高碳载量色谱柱SUPERIOREX ODS进行分析。
使用CAPCELL PAK C₁₈ MGII色谱柱在30℃条件下对头孢氨苄及其异构体△-2-头孢氨苄进行分离，分离度为1.05，分离效果不及CAPCELL PAK C₁₈AQ；使用SUPERIOREX ODS色谱柱进行分析，分离度为1.18，分离效果略优于AQ柱，但在分析破解所得分离度溶液时，杂质峰形及分离效果不佳。
在对头孢氨苄及其异构体△-2-头孢氨苄的分离中，本实验室也尝试使用键和金刚烷基团的高表面极性色谱柱CAPCELL PAK ADME和键合五氟苯丙基、对同分异构体有良好分离能力的CAPCELL PAK PFP色谱柱进行尝试。
由于ADME色谱柱保留较强，在原梯度条件下未得到待测物洗脱，提高梯度条件中有机相比例后，亦未得到理想的分离效果；而使用CAPCELL PAK PFP S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm（TQAD01002）色谱柱进行分析，能得到4.84的分离度（见图5）。
表1为各色谱柱分离度结果对比。

图5 头孢氨苄及△-2-头孢氨苄混合溶液结果（PFP色谱柱）

表1 各色谱柱分离度结果对比（色谱柱规格S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm）

进一步，使用PFP色谱柱在原色谱条件下对供试品溶液、杂质对照溶液、△-2-头孢氨苄对照溶液、高温破解溶液及空白溶液进行分析。供试品溶液中各杂质能得到良好分离，主峰头孢氨苄与杂质△-2-头孢氨苄分离度为1.78（见图6），杂质对照品溶液中7-ADCA和α-苯甘氨酸的分离度为7.28（见图7）。

图6 供试品溶液、空白及△-2-头孢氨苄溶液分析所得色谱图（PFP色谱柱）

图7 80℃破解溶液及杂质对照溶液分析所得色谱图（PFP色谱柱）

综上实验结果，在C₁₈系列色谱柱中，使用资生堂CAPCELL PAK C₁₈AQ S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm（A6AD04229）色谱柱分析头孢氨苄有关物质结果最优，能够实现杂质对照溶液及高温破解所得分离度溶液的分离。在供试品溶液分析中，由于浓度较高，△-2-头孢氨苄被包于主峰中，客户反馈属正常现象，单独考察低浓度头孢氨苄与其异构体△-2-头孢氨苄的混合溶液分离情况，能够达到1.17的分离度结果。

在头孢氨苄及其异构体△-2-头孢氨苄的分离中，相比C₁₈柱，资生堂CAPCELL PAK PFP S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm（TQAD01002）色谱柱能够达到分离度为4.84的良好分离结果，在杂质对照溶液及供试品溶液的分析中，能够得到满足药典分离要求的良好结果，供客户参考。