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牛奶中为什么会出现四环素呢?原来,四环素类抗生素,因为用于奶牛的消炎治疗,然后会有残留,在牛奶中有少量药物的存在。因此,牛奶中的四环素类抗生素的检测显得尤为重要!月旭科技参照国家标准,对牛奶中的四环素类抗生素进行检测,现将详细操作步骤分享给大家。
1、适用范围:适用于牛奶中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定。参考标准
《GBT 22990-2008 牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定
液相色谱-紫外检测法》
3、原理:
试 样 中 四 环 素 类 抗 生 素 残 留 用 0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液 (pH=4.0±0.05):甲醇 (9:1) 提取,经涡旋和离心后,取上层清液,用月旭公司 BRP 固相萃取柱净化,然后用 HPLC-UV 测定,外标法进行定量。
4、试剂:
试剂1:磷酸氢二钠 0.2mol/L:称取十二水合磷酸氢二钠 71.63g,加水溶解,稀释到 1000mL。
试剂2:柠檬酸 0.1mol/L:称取柠檬酸单水合物 21.04g,加水溶解,稀释到 1000mL。
试剂3:移取 625mL 试剂1 与 1000mL 试剂2,混匀。
试剂4:0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine:称取 60.5g 乙二胺四乙酸(EDTA)二钠盐,用试剂3 溶解并混匀。用 0.1mol/L 的 HCl 或 NaOH,调节 pH 至 4.0±0.05,4℃ 保存。
提取液: Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液:甲醇=(9:1)。
5、提取步骤:
称取 5g 牛奶样品,加入 20mL 提取液,涡旋混合 1min,常温超声 10min,4000r/min 离心 10min,将上清液转移到 50mL 的容量瓶中,再分别用 15mL、10mL 提取液重复上述提取操作,合并上清液,并用提取液定容到 50mL,转移到离心管中,待净化。
6、SPE净化步骤:
SPE柱:月旭 Welchrom® BRP,
规格:200mg/6mL。
a) 活化:5mL 甲醇,5mL 水,弃去。
b) 上样:移取待净化液 5mL,弃去。
c) 淋洗:用 5mL 水淋洗小柱,弃去淋洗液,并抽干小柱。
d) 洗脱:用 2mL 甲醇,稍用负压将小柱湿润,再用 20mL 乙酸乙酯洗脱,收集洗脱液,抽干小柱。
e) 浓缩:将收集的洗脱液在 40℃ 加热条件下氮吹吹干,然后用甲醇复溶并定容到 1mL,并过 0.22μm PTFE 滤膜,上高效液相色谱仪检测。
7、注意事项:
(1) 标准是用 0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine 进行提取的,但实验效果不佳,后改成 Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液:甲醇=(9:1)。
(2) 在过 SPE 小柱的过程中,“活化”和“上样”这两个步骤要注意不要使得小柱干涸,这样会影响小柱的回收率。而在“淋洗”步骤一定要抽干,因为乙酸乙酯和水是不互溶的。(3) 加标过程:样品的加标量分别为 2mg/kg,1mg/kg,往 5g 牛奶加入 1mL 10μg/mL 和 0.5mL 10μg/mL 混标溶液,然后用提取液提取,最后用 Na2EDTA-Mallvaine 缓冲液定容至 50mL,准确移取 5mL 上固相萃取柱净化,最终定容到 1mL。8、色谱条件:色谱柱:月旭Ultimate®Plus-C18(4.6 x 250 mm, 5 μm)
流动相:
A:0.01 mol/L 草酸溶液 B:乙腈:甲醇=18:5
洗脱梯度:
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流速:1.0mL/min
进样量:10μL
柱温:30oC
检测波长:350nm
9、色谱图或者加标回收率结果:
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图1:牛奶样品色谱图
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图2:对照品 0.5 μg/mL 色谱图
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图3:牛奶样品加标 1mg/kg 图谱
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图4:对照品 1 μg/mL 色谱图
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图5:牛奶样品加标 2mg/kg 图谱
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由表1 可知,采用固相萃取结合高效
液相色谱检测四种四环素类药物,加标量为 1.0mg/kg、2.0mg/kg,回收率为 82%~111%,能够满足检测要求。
由图1-5 可看出经 Welchrom® BRP 固相萃取柱净化,采用 Ultimate®Plus-C18 色谱柱检测能够使四种四环素药物得到良好的分离,且各种物质峰形良好,保留时间稳定。
10、相关产品信息: 货号 | 名称 | 规格 |
00522-20014 | Welchrom®BRP | 200mg/6mL,30pk |
00000-30013 | 15mL螺口尖底离心管 | 100支/包 |
00000-30016 | 50mL螺口尖底离心管 | 50支/包 |
00824-31001 | Welch 固相萃取装置 | 12位方缸 |
00802-02201 | 针头式过滤器 Nylon | 13*0.22 100pk |
00824-11101 | 一次性注射器 | 200pk/盒 带针头 橡胶头 1ml |
00821-32291 | 盖子+垫片 | 预切口红色特氟龙/白色硅胶隔垫,9mm蓝色短螺纹开口盖 中心孔6mm |
00821-40927 | 样品瓶 | 2ml 透明短螺纹广口样品瓶 带书写处11.6*32mm 一级水解玻璃 |
00260-31043 | Ultimate®Plus-C18 | 4.6 x 250 mm, 5 μm |
00826-T156P250 | 盐酸四环素标准品 | CAS No.:64-75-5, 250mg |
00826-C162P250 | 盐酸金霉素标准品 | CAS No.:64-72-2, 250mg |
00826-O024P250 | 盐酸土霉素标准品 | CAS No.:2058-46-0, 250mg |
00826-D428P100 | 盐酸强力霉素(盐酸多西环素)标准品 | CAS No.:24390-14-5, 100mg |