硝基咪唑的危害及检测目的硝基咪唑类药物(nitroimidazole,NMZs)是一类具有抗原虫感染和抗厌氧菌的硝基杂环类抗菌药物,其具有抗菌和抗原虫作用。近年来作为饲料添加剂广泛应用于畜牧业生产中,同时也是一种生长促进剂,以促进畜禽的生长及改善饲料的转换率。由于这类化合物含有的硝基杂环类物质具有潜在致癌、致畸和致突变作用,因此欧美等发达国家已禁止在食源性动物中使用硝基咪唑类药物。我国也对硝基咪唑类药物进行了严格的限制,2020年生效实施的GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》中仅规定了甲硝唑和地美硝唑两种物质允许作治疗使用,但不得在动物性食品中检出;同年农业农村部公告第250号,将洛硝达唑、替硝唑列入《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》中。本文阐述了如何将硝基咪唑类化合物从样品基质中分离提取出来,并经过净化后,转化成液质联用仪可以检测的形式。以提取、净化为重点,依据国标GB/T 21318-2007,为检测人员和相关领域研究人员提供一定的参考。检测项目:硝基咪唑类原药及代谢产物应用范围:猪肉/鸡肉/牛肉/猪肝/鸡肝/牛肝/猪肾/牛肾/鱼肉/奶粉/蜂蜜液相色谱-质谱/质谱法
方法原理:样品中残留的8种硝基咪唑、2种代谢物用甲醇-丙酮均质或超声波提取,经乙酸乙酯液液分配,以凝胶色谱(GPC)净化,再经固相萃取(SPE)净化,采用液相色谱/串联质谱确证,外标法定量测定。
前处理仪器:凝胶色谱仪(配有馏份收集浓缩器);组织捣碎机;均质器;超声波发生器;旋转蒸发器;高速离心机;氮吹仪;固相萃取装置;具塞锥形瓶(250 mL);分液漏斗(250 mL);浓缩瓶(50 mL、250 mL)。检测仪器:LC-MS/MS+ESI源
前处理方法
1.提取
肌肉组织、脏器组织样品及水产品准确称取约20 g样品(精确至0.1 g)于250 mL具塞锥形瓶中,加入10 g硅藻土(80目~120目)与样品充分混匀,再依次加入5 mL饱和氯化钠水溶液和70 mL甲醇-丙酮(3+1),高速均质提取3 min。将提取液移入离心管中,于10000 r/min离心2 min,将上层提取液移入250 mL浓缩瓶中。残渣每次再用50 mL甲醇-丙酮(3+1)重复提取两次,合并提取液。
蜂蜜、乳及乳制品样品准确称取约20 g样品(精确至0.1 g)于250 mL具塞锥形瓶中,加入10 mL饱和氯化钠水溶液和70 mL甲醇-丙酮(3+1),超声波提取30 min。移入离心管中,于10000 r/min离心2 min,将上层提取液移入250 mL浓缩瓶中。残渣每次再用50 mL甲醇-丙酮(3+1)重复提取两次,合并提取液。
2.液液分配将提取液于40 ℃水浴中旋转浓缩至只剩水相,并转移至250 mL分液漏斗中,加入50 mL饱和氯化钠水溶液和25 mL乙酸乙酯,振摇3 min,静置分层,收集乙酸乙酯相。水相再用20 mL乙酸乙酯重复提取两次,合并乙酸乙酯相。经无水硫酸钠柱脱水,收集于250 mL浓缩瓶中,于40 ℃水浴中旋转浓缩至近干,加入5 mL乙酸乙酯-环己烷(1+1)溶解残渣,并用0.45 μm滤膜过滤,待净化。
3.净化
凝胶色谱(GPC)净化
凝胶色谱净化条件如下:净化柱:700 mm×25 mm,Bio Bcads S X3,或相当者;流动相:乙酸乙酯-环己烷(1+1);流速:4.7 mL/min;样品定量环:5.0 mL;预淋洗体积:50 mL;洗脱总体积:210 mL;开始弃去体积:90 mL;收集体积:90 mL;最后弃去体积:30 mL。凝胶色谱净化步骤如下:将5 mL待净化液按照凝胶色谱净化条件进行净化,合并馏份收集器中的收集液于250 mL浓缩瓶中,于40 ℃水浴中旋转浓缩至近干,加入5 mL甲醇以溶解残渣,待净化。
固相萃取(SPE)净化使用前用5 mL甲醇预淋洗C18固相萃取柱(1 g,6 mL),将5 mL溶解液倾入C18固相萃取柱中,以1 mL/min的速度收集流出液,再用10 mL甲醇进行洗脱。收集全部洗脱液于50 mL浓缩瓶中,于40 ℃水浴中旋转浓缩至干。用甲醇溶解并定容至1.0 mL,经0.45 μm滤膜过滤后,供液质测定和确证。
国标解读及注意事项1.硝基咪唑标准物质用甲醇配成1000 μg/mL的标准储备液,在0 ~4 ℃条件下避光保存,可使用12个月。2.如果有条件,建议凝胶色谱净化系统中配合使用紫外检测器,准确监测目标化合物及杂质的流出情况。3.固相萃取净化过程中,C18柱作为净化柱使用,注意上样过程中就需要收集流出液,再和洗脱液进行合并。
4.国标方法中使用基质添加标准曲线,外标法进行回收率的校正。注意做肉类样品的基质添加标准曲线前,先进行洗涤,然后加标,再进行后续提取净化等流程。
5.建议使用硝基咪唑标准物质相对应的同位素内标,进行回收率的校正。
参考文献GB/T 21318-2007 动物源食品中硝基咪唑残留量检验方法
图1 肌肉组织、脏器组织样品及水产品中硝基咪唑残留量测定的前处理流程图
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图2 蜂蜜、乳及乳制品样品中硝基咪唑残留量测定的前处理流程图
表1 硝基咪唑标准物质信息表
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