主题：【第十三届原创】GBT 23381-2009液相色谱法检测豆芽中的6-苄基腺嘌呤

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鹤壁农检联合队发表于：2020/06/01 06:38:58 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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GBT 23381-2009液相色谱法检测豆芽中的6-苄基腺嘌呤

6-苄氨基嘌呤（6-BA）是一种人工合成的细胞分裂素，与植物内源激素具有相似的结构和性质，能够抑制植物叶内叶绿素、核酸和蛋白质分解，广泛用作无根豆芽的生长调节剂。它是一种能使豆芽细胞快速分裂的激素类农药，同氮肥一样对人体都有致癌、致畸的作用。超量摄入激素类药品后，会对人体产生一定的危害，如使儿童发育早熟、女性生理发生改变、老年人骨质疏松等等。即使有些危害不会在短时间内出现，但是长久沉积必然会给健康带来不利影响。

试剂：0.02 mol/L醋酸铵水（0.1%乙酸）：1.0 L超纯水中加入1.54 g醋酸铵和1.0 mL冰醋酸，混匀超声，过0.45μm滤膜备用；

2.5%甲酸水：2.5 mL甲酸加入水中，定容至100mL；

20%氨水甲醇：20mL氨水加入甲醇定容至100mL；

20%甲醇水：量取20 mL甲醇、纯水定容至100mL，混匀备用；

混合型阳离子交换柱；60mg，3mL，使用前分别用3mL甲醇、3mL 2.5%甲酸水活化；

方法原理

6-苄氨基嘌呤:豆芽样品经粉碎后在酸化的乙腈水溶液提取条件下提取效率高、能消除干扰。高效液相色谱测定，紫外检测器检测，以保留时间定性，峰面积或峰高定量。

前处理条件

称取样品10.0g至50 mL离心管, 加入20 mL甲醇，超声提取15 min，4000r/min 离心5分钟，上清夜转移至150mL鸡心瓶中，再加入20mL甲醇，超声提取15 min，4000r/min 离心5分钟，合并上清液，用旋转蒸发仪40℃减压浓缩（水浴温度不得超过60℃），除尽甲醇。残液中加入3滴6 mol/L HCl（残液体积不足2mL时，加入3 mL 2.5%甲酸水），涡旋，高速离心，上清液过用3 mL甲醇、3 mL 2.5%甲酸水活化过的PCX小柱净化，依次用3 mL 2.5%甲酸水和3 mL甲醇洗涤柱子，再用5 mL 10 %氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于50℃氮气吹干，20%甲醇水涡旋洗脱，定容5.0mL，过0.45 um水膜，上机测定。

【说明】：标准中称样量为10.0 g，40 mL甲醇分两次超声提取后，使用C18固相萃取柱净化，甲醇定容，过0.45 um有机膜后上机测定。本文使用阳离子交换柱净化，20%甲醇水洗脱，过水膜后上机测定。

[1] 温度高时，6-苄基腺嘌呤容易发生转化；

[2] 调pH=1.0~2.0，低于6-苄基腺嘌呤pKa（为3.8）两个单位，保证6-苄基腺嘌呤上柱前99%以上处于离子态，保证回收；减压浓缩除尽甲醇后，剩余液体的体积大于4 mL，可以不加3 mL 2.5%甲酸水，直接使用6 mol/L HCl调节酸性后，高速离心，上柱净化；

[3]高速离心，沉淀非水溶性固体，溶液澄清后提高过柱速度；

[4]使用5%氨水甲醇5 mL洗脱，阳离子交换柱上有残留，回收低；

[5]若使用有机滤膜会引入吸收波长为247nm的干扰峰。

[6]干样称2 g，加8 mL水，提取、净化步骤同新鲜样品，使用5%氨水甲醇3 mL洗脱，收集洗脱液，于50℃氮气吹干，20%甲醇水洗脱，定容1.0 mL。

[7]因流动相中含有0.1%乙酸，仪器要平衡足够长时间（待基线完全直线,一般一个小时以上）

仪器分析条件

1、色谱的选择

6-苄氨基嘌呤在甲醇和乙腈等有机试剂中有较好的溶解度，用这些试剂提取再配合液相色谱仪，可大大简化前处理过程，缩短前处理时间，且高效液相色谱仪应用较为普遍，其易于推广应用，实用性强。

2、色谱的优化

实验过程中通过对色谱条件规定的参数要求进行了多次调整，以使仪器的灵敏度、稳定性和分离效率均处于最佳状态，获得满意的分离效果，达到回收率的要求。经过多次的试验摸索，确定实验参数。

(1)色谱柱的选择

选用C18色谱柱，该色谱柱可在宽pH 范围(pH 2-9) 内提供良好的峰形，实验证明，该色谱柱适合分离豆芽中的6-苄氨基嘌呤，峰形完全能满足检测要求且与干扰物质进行有效分离。

(2) 色谱条件的选择

通过对0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤的甲醇溶液并以甲醇为参比进行200-400 nm范围的紫外扫描，结果发现，6-苄氨基嘌呤在267nm处有最大吸收，因此紫外吸收波长确定为267nm。

6-苄氨基嘌呤光谱图

（3）仪器的工作条件为：

仪器型号：WATERS 2695色谱柱： C18/250*4.6mm

检测器：PDA 267 nm进样量：10μL；流速：1.0mL/min柱温：35 ℃

流动相：梯度洗脱 B:甲醇； A:0.02 mol/L醋酸铵乙酸水（0.1%乙酸）

（4）液相色谱法线性范围

6-苄氨基嘌呤标准系列工作液浓度分别为0.10 mg/L、0.2 mg/L、0.5mg/L、1.00 mg/L、2.00 mg/L、将各浓度按照建立的方法依次进样后，检测得出一系列峰面积与浓度的对应点，连点成线，得到拟合标准曲线，直线方程为Y=0.9013X-0.0051，相关系数r=1.0000。可见在0.1～2mg/L浓度范围内线性很好。如果实测样品的含量超过此范围，可对其进行稀释。

方法检出限：取豆芽样品，加标浓度为0.05mg/kg，S/N值为6.2。

样品检出限色谱图

方法的回收率

分别以黄豆芽和绿豆芽为加标对象，分别加入2个水平的6-苄氨基嘌呤标准溶液，进行回收率的测定，每个样品重复6次，计算出每个添加水平的回收率和相应的相对标准偏

差（RSD）值。方法回收率结果见表1。

样品加标0.1mg/kg堆栈难色谱图

样品加标0.25mg/kg堆栈难色谱图

6-苄氨基嘌呤属五大类植物激素中的细胞激动素类，其主要功能为促进非分化组织分化，促进生物体内物质的积累，促进侧芽发生，防止老化等作用，因此被广泛应用于农业、果树和园艺作物从发芽到收获的各个阶段。因此，有所检出可能为豆子本身的残留，而非人为添加。

结论：

【说明】：1、标准中称样量为10.0 g，40 mL甲醇分两次超声提取后，使用C18固相萃取柱净化，甲醇定容，过0.45 um有机膜后上机测定。本文使用阳离子交换柱净化，20%甲醇水洗脱，过水膜后上机测定。

2、温度高时，6-苄基腺嘌呤容易发生转化；

3、调pH=1.0~2.0，低于6-苄基腺嘌呤pKa（为3.8）两个单位，保证6-苄基腺嘌呤上柱前99%以上处于离子态，保证回收；减压浓缩除尽甲醇后，剩余液体的体积大于4 mL，可以不加3 mL 2.5%甲酸水，直接使用6 mol/L HCl调节酸性后，高速离心，上柱净化；

4、高速离心，沉淀非水溶性固体，溶液澄清后提高过柱速度；

5、使用5%氨水甲醇5 mL洗脱，阳离子交换柱上有残留，回收低；

6、若使用有机滤膜会引入吸收波长为247nm的干扰峰。

7、干样称2 g，加8 mL水，提取、净化步骤同新鲜样品，使用5%氨水甲醇3 mL洗脱，收集洗脱液，于50℃氮气吹干，20%甲醇水洗脱，定容1.0 mL。

8、因流动相中含有0.1%乙酸，仪器要平衡足够长时间（待基线完全直线,一般一个小时以上）

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