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气相色谱（GC）
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主题：【第十四届原创】老生常谈：做气相色谱怎么打针？

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xx_dxd_xx
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发表于：2021/08/11 22:58:16 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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老生常谈：做气相色谱怎么打针？

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摘要：进样是制约气相色谱法定量准确性的关键步骤。要想实现准确进样，必须认识样品从注射器转移进入色谱柱的详细过程，必须理解针头效应、注射歧视、初始带宽、溶剂效应、分流歧视等重要概念。
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气相色谱法诞生已有70余年，理论日趋成熟、仪器日新月异，方法的灵敏度与数十年前相比已经不知提高了几个数量级，但是在准确度方面一直有一个绕不过去的坎：重现性3%。

查阅国外六十年代的文献和国内七八十年代的标准，就会发现那时候气相色谱法的重现性就已经是RSD=3%左右。而当今最新的仪器和标准，这个指标仍然没有大的进步。这不禁令人疑惑，到底卡在哪？

答案就是：卡在打针上面！

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气相色谱进样俗称打针，看似简单，却是影响仪器重现性的最重要瓶颈。为什么呢？我们要先搞清楚进样的目的和过程。首先，目的很明确，是要将一定体积的样品转移到色谱柱里面去。那么如何实现这一目的呢？这其中需要经过好几个复杂的过程：1、用注射器吸入一定体积的样品；2、将一定体积的样品注入进样口；3、使一定体积的样品转化为蒸汽；4、将样品蒸汽全部或者按比例送入色谱柱。以上这4个步骤都需要定量完成，任意一个步骤产生误差都将导致结果不准确，最直接的表现就是RSD变大。以下对这4个步骤逐一分析。

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第一步：用注射器吸入一定体积的样品

这一步是比较简单的，与移液管操作类似，遵循分析化学的常规原则即可。一般强调两点，一个是润洗，另一个是排气泡，至于观察读数的准确性问题反倒是其次了。微量注射器体积小、金属与玻璃接触部分有较多死角，需要充分润洗才能保证不引人杂质、不改变样品浓度。一般要用溶剂润洗5次以上、待测样润洗5次以上，才能保证吸入的样品浓度与原始样品的浓度完全一致。排除气泡十分重要，否则吸入的体积将显著低于刻度所示的体积。排气泡的操作有不少技巧，比如慢吸快推、垂直轻敲注射器等，总之要保证注射器内部，包括针头内部完全充满样品、没有任何微小气泡。

有人认为注射器内部有小气泡不影响准确度，因为进样前后都有气泡，相当于差减法，气泡产生的误差被抵消了。这种想法是极端错误的，因为气相色谱进样口的压强高于常压，进样操作时注射器内部样品受到的压强显著大于吸取样品时的压强，如果存在气泡，其体积将被压缩，因此气泡必然会导致进样体积小于注射器示数。

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第二步：将一定体积的样品注入进样口

这一操作看起来也比较简单，将注射器插入进样口并且推到底，然后拔出来就好了。

第三步：使一定体积的样品转化为蒸汽

这一步看起来不需要我们来操作，样品受热自然会气化。
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但是要注意，上述两个步骤不是先后进行的，而是同步的。因为将样品注入的操作需要一定时间才能完成；而样品气化则是很快的，受热同时就会发生气化。也就是说，从注射器接触进样口的一瞬间开始，气化就开始进行了。因此对这两步操作的误差要综合起来分析。
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这里首先要知道一个重要的概念：针头效应。

注射器刻度显示的体积并不是其内部容纳的全部液体体积，注射器推到刻度0时，其内部仍然残存少量液体。残存的这部分体积存在于针头内部。

如果是常温下使用，残存的这一部分不会产生误差，因为针头里面总是充满液体的，通过差减法就能把残存的体积抵消掉，实际注入的体积与刻度显示的没有差别。液相色谱的进样就是这种情况，因此很容易做到准确控制体积，重现性可达到1%以下。

而气相色谱进样，针头必须插入高温的进样口，内部残存的液体受热后也会气化，因此实际注入的体积比刻度显示的值更大。而气化的多少与受热时间有关，因此操作速度越慢，偏大就越多。这就是气相色谱进样中存在的针头效应。
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下面进一步对针头效应进行半定量的分析。假设注射器刻度为X0，注射器针头里面死体积是Y0，

除了X0体积被注入色谱仪进样口以外，针头死体积内液体受热也会挥发一部分出一部分体积Y，实际进样体积X=X0+Y。

X0是确定的，但是Y并不确定。

如果做到瞬间进样，停留时间为0，则Y0完全不会挥发，Y=0；

如果停留时间足够长，则Y0完全受热挥发，Y=Y0。

但实际操作中停留时间为0和停留时间足够长都是做不到的，即：0＜Y＜Y0。

所以实际进样体积X是一个不确定的范围：X0＜X＜X0+Y0。

在实际操作中如果让Y保持一个定值，针头效应就是系统误差，可以通过标样来校正，这就需要保持每次进样的停留时间固定。这对手动进样来说不容易做到，但是机器很容易实现每次时间一致，因此自动进样器是提高进样重现性的重要办法。实际情况也正是如此。

手动进样时Y的随机误差不可避免，那么什么情况下能让Y引入的随机误差变小呢？由于X=X0+Y，加合时传递绝对误差，而分析人员的一般经验表明，数值越小时，其绝对误差通常也越小。也就是说，操作中尽量减小Y值，其引入的误差也随之减小，相应的就需要减少针尖受热的时间。这就是为什么在手动进样时强调速度快，扎针、推活塞、拔针一气呵成，中途不能有丝毫停顿。整个过程越快，针头受热时间越短，对应的随机误差也越小。

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想要减小Y引入的随机误差，有人想到了另一个途经：如果让针头在进样口里面多停留一段时间，也就是针头受热时间趋近于足够长，那么针头里面的液体趋近于完全挥发，Y趋近于Y0，这时候就能把Y当做是固定值了，其引入的随机误差也就基本上消除了。这一想法有一定道理，很多厂家的安装工程师在安装验收的时候也是这样做的，效果似乎还不错。

但是要注意，这种做法存在两方面的问题：一个是峰展宽，另一个是注射歧视。

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初始带宽的概念和影响

在塔板理论中，是假设样品只加载到第0块塔板上，然后开始两相分配。也就是说假设初始带宽为0，或者初始带宽足够窄以至于可以忽略不计。但是这种假设只在理想状态下存在。当初始带宽较宽时，样品不能瞬间加载到第0塔板，而是以较慢的速度逐步进入色谱柱；先进入色谱柱的样品不会等待后面较慢的样品，而是向下一塔板移动；等到后面的样品也进入第0塔板，先进入的样品可能已经移动到第1、第2、甚至更加后续的塔板上面。这一现象导致的结果就是色谱峰比理想情况更宽，从数学角度上讲就是：实际峰宽是初始峰宽与塔板分配峰宽的卷积。

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卷积的概念不太容易理解，因此这里不过多的进行数学分析，只从一般经验上进行近似的解释。假设理想状态的峰宽是3s，这是假设样品瞬间进入色谱柱得到的。如果样品进入色谱柱比较慢，总共用了1s，也就是说最早进入的样品与最晚进入的样品相差1s，那么原来正态分布的理想峰型就被拉宽了1s。如果进样速度更慢，总共花3到5秒才完成，那么峰变宽就更加明显了。回到前面说的让针头在进样口里面多停留一段时间的做法，这样导致的结果很明显：通过推活塞注射的样品先进入色谱柱，停留阶段逐渐挥发的样品后进入色谱柱，停留时间越长前后差距就越大，峰变宽也就越严重。并且要注意，前面说的变宽的情况是假设样品匀速进入，而对于让针头在进样口里面多停留一段时间的做法，先推活塞时样品进入较快，后面停留阶段样品挥发越来越慢，这种速度减慢是接近指数形式衰减的，也就是我们平时经常见到的拖尾现象。也就是说，注射器停留会造成拖尾问题，停留时间越长拖尾越严重。所以这种让针头在进样口里面多停留一段时间的做法是不可取的。这里要补充说明一下，注射器停留时间长是导致拖尾的原因之一，但不是全部原因，还有很多其他因素也会导致拖尾，遇到问题时要具体分析，不能一概而论。

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针头在进样口中停留时间长还会带来另外一个问题：注射歧视

前面已经分析过，进样的目的是要将样品定量引入色谱仪。所谓定量，除了前面已经讨论的体积问题外，还有组成问题，也就是说要保证引入样品的浓度与原始样品是一致的。这一问题经常不被重视，但确实广泛存在。前面已经提到过，除了注射器活塞注入的一定体积的样品外，针头内部的样品也会受热挥发一部分。那么是否考虑过，挥发的这一部分，其组成与原始样品一致吗？答案显然是否定的，低沸点组分显然挥发更多、高沸点组分显然挥发较少。也就是说：针头效应导致实际进样体积大于注射器的读数，并且这种偏大对于不同组分是不一样的，低沸点组分偏大较多，高沸点组分偏大较少，进入色谱仪的样品组成与原始样品组成存在差异。这种导致样品组成失真的现象就叫做注射歧视。

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由以上分析可知，只有保证针头在进样口里面停留时间足够短，才能减少注射歧视，避免样品组成的失真。所以仍然强调进样操作要快。

另外要注意的是，强调针头在进样口里停留时间短，不仅仅是指推完活塞之后不要停留，推活塞之前的操作也要快。因为从针头接触进样口的瞬间起，内部样品就会开始受热挥发。如果扎针速度较慢、扎针到推活塞的过程停顿较长，样品在推活塞之前就会挥发出来，这种挥发过程也存在低沸点组分挥发快、高沸点组分挥发慢的的问题，同样导致样品组成失真。而且这种停顿也会导致峰变宽的现象，其原理与前面讨论的拖尾问题类似，且表现更加严重，有时候甚至导致一个峰分裂成两个。这种现象叫做二次进样或多次进样，就是样品没有一瞬间完全进入，而是分成两次或者多次进入。

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正是由于针头效应带来的一系列问题，气相色谱定量中有一个重要的注意事项：溶剂效应

前面已经分析，由于针头效应的存在，实际进样体积大于注射器刻度示值，偏大多少受两方面影响，一是停留时间，二是样品挥发速度。而样品中溶剂占绝大多数，其沸点和性质对挥发速度影响很大。所以当溶剂不同时，实际的进样体积是显著不一样的，获得的目标峰强度也会有显著差异。这就是气相色谱定量中不可忽视的溶剂效应。

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为了减少溶剂效应带来的定量误差，一般做法较为简单，就是保持待测样与标样的溶剂尽可能一致，并且浓度都接近。当样品浓度很小时（比如小于1%），体系中绝大部分都是溶剂，可以不考虑溶质的影响，此时可以认为溶剂效应是一致的。也就是说，遇到待测样与标样浓度不一致时，适当稀释是解决溶剂效应的一个简单方法。

值得说明的是，目前有一种活塞直接插入针头的微量注射器，声称是无残液注射器。理论上说，如果完全做到无残液无死体积，就可以消除针头效应，上面提到的所有问题都迎刃而解。但实践表明，这种声称的无残液注射器并不能真正做到无残液，只是将残液最大程度减小而已，因此仍然存在针头效应及其导致的相应问题，使用时仍要十分注意。

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第四步：将样品蒸汽全部或者按比例送入色谱柱

这一过程看似简单的传递，却更为复杂，因为除了物理上的流动和传递，还存在化学上的吸附、分解、反应等问题。吸附、分解、反应等问题必须结合样品的具体性质考虑，这里暂且不讨论，主要从物理过程的角度讨论样品的传递。

样品蒸汽转移进入色谱柱的方式主要有直接进样、分流进样、不分流进样三种。

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对于填充柱和大口径毛细管柱常采用直接进样，样品蒸汽完全转移进入色谱柱，一般不存在损失，因此这种进样操作是较为容易实现的。但前提是要保证样品蒸汽不会溢出到进样口衬管以外，因此需要将样品注射到衬管中部，也就是掌握好针头插入的深度，保证注射器完全插入到位之后再推活塞。如果在针尖刚进入的时候就推了活塞，样品就容易溢出到衬管以外，不仅导致实验结果不好，还容易污染管路。另外，防止蒸汽溢出衬管还需要保证气化体积不超过衬管容积的3/4，当溶剂为水、甲醇、DMF等时尤其要注意进样体积必须很小才行。有时候为了防止这些气化体积大的溶剂蒸汽溢出衬管，还需要适当减慢注射速度（约0.5μL/s）。但是这种操作很难掌握，不建议使用。

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对于分流进样，除了与直接进样一样需要防止样品蒸汽溢出衬管外，还有一个重要的要求，就是让样品蒸汽分流的比例与载气分流的比例一致，否则就无法实现定量。

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分流歧视导致样品分流比与载气分流比不一致

分流本来是针对样品蒸汽的，但是我们无法控制样品蒸汽，而只能控制载气，因此所谓的分流比是指载气的分流比。只有当样品完全气化，并且其蒸汽与载气完全均匀混合时，样品的分流比才与载气的分流比一致。否则就无法实现定量的分流，定量分析也就无从谈起。但在实际操作中，样品气化速度受其自身性质影响，各组分并不相同，与载气混合的过程也难以保证完全均匀，因此样品的分流比与载气的分流比会存在差异。这种差异称作分流歧视，是影响分流进样重现性和准确度的关键问题。

为了减小分流歧视、保证分流比的重现性和准确性，需要从多方面采取措施，其中最重要的是进样口结构和衬管形状的设计，以及实验条件的设置，但进样操作也是十分重要的。

这里主要讨论进样操作。一方面是要保证注射器针头插入的高度正确，这主要是要选好合适的注射器。目前的进样口和衬管大部分是针对50mm针头设计的，如果错误的选用了70mm针头的注射器，将导致插入过深，样品注入的位置离分流点太近，样品还没来得及与载气混匀就进入分流点，导致分流不定量。另一方面也是要注意迅速注射进样。样品只有在同一瞬间注入衬管，才能有一致的气化和流动行为；如果注入的时间存在先后差异，前一部分和后一部分的受热状态和流动状态都有差异，必然影响气化的完全程度和混合的均匀程度，最终影响分流的重现性和准确性。

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对于不分流进样，关键点主要是方法条件的优化，这方面要综合考虑样品的性质，这里暂不讨论，可参阅相关专著。

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总结：以上通过详细分析气相色谱进样整个过程和相关原理，逐一说明了进样操作的要点和注意事项。有人也许认为这种分析有点小题大做，本来简单几步的打针操作被说的异常繁琐。也有人会觉得这种知识无关紧要，因为自动进样器早已普及，几乎不用手动打针了。然而须知，仪器是人设计制造的，仪器也必须在人的指挥和监督下运行。因此实验人员不能只做简单的重复操作，要有管理者和指挥官的责任与自觉。这就要求每个实验人员都明白仪器的原理，知道为什么这样做，从而实现有效的指挥和监督。简单重复的劳动领域，机器正在不断取代人工，如果实验员安于现状、不求甚解，岂不是最终落得连机器都不如？
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RBLEGEND
v3031903
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2021/8/12 8:34:44 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
感觉气相相关的帖子容易火，莫非大家都是 做气相的？
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JOE HUI
xurunjiao5339
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2021/8/12 9:02:02 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
版友总结经验不错!
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zyl3367898
zyl3367898
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2021/8/12 19:27:31 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
太厉害了，从打针引伸出来这么多理论知识，推荐给同事们看。
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Streev
m3328442
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2021/8/12 20:50:30 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 RBLEGEND(v3031903) 发表:感觉气相相关的帖子容易火，莫非大家都是 做气相的？
那是，很多人都是搞气相的。
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zyl3367898
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2021/8/12 23:30:00 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
实验室安于现状的人不少，要像楼主学习。
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m3336169
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2021/8/13 8:01:28 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
可不可以这么操作。让进样针吸取一定量的空气，比如安家的1ul样品+0.2ul的空气。这样针尖的液体都会被推出来了。
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xx_dxd_xx
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2021/8/13 13:05:11 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 m3336169(m3336169) 发表:可不可以这么操作。让进样针吸取一定量的空气，比如安家的1ul样品+0.2ul的空气。这样针尖的液体都会被推出来了。
是的，有些特殊的操作方法，比如三明治进样法，都是在了解了进样过程和针头效应的前提下进行的改进。三明治进样法，先吸入1uL溶剂，然后吸0.5uL空气，再吸1uL样品，最后吸1uL空气。不过这样做太麻烦，而且效果提升不是很明显，如果操作熟练，做到连贯迅速，没必要用这种方法
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罗亚檀香
v2970225
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2021/8/13 21:51:44 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
专业！
老师，想请教一下您，自动进样器进样，吸取样品进样前的最后一次润洗还看到有气泡，这个正常吗？

自动进样器进样，偶尔也会有某些原料出两个峰（应只有一个峰），奇怪。
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zyl3367898
zyl3367898
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2021/8/13 23:24:27 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
换个进样针。出两个峰说明有残留，可以多进几个溶剂，基线平稳后再进样。
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xx_dxd_xx
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2021/8/14 2:47:45 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 罗亚檀香(v2970225) 发表:专业！老师，想请教一下您，自动进样器进样，吸取样品进样前的最后一次润洗还看到有气泡，这个正常吗？自动进样器进样，偶尔也会有某些原料出两个峰（应只有一个峰），奇怪。
自动进样器是靠惯性快速推出气泡，对于一些很小的气泡不容易排出去，因为这种小气泡受浮力作用占主导，总是浮在上面。据我观察，很多厂家的自动进样器都会偶尔出现这种问题。这个问题对于自动进样器无解，只能按手动进样的方式把注射器倒过来排出气泡。不过这种情况下排不出去的气泡一般非常小，估计误差不会很大。峰分裂的问题比较复杂，有时候进样太快导致蒸汽倒灌会有这种现象，比如进甲醇或水溶液。还有可能与色谱条件有关，比如不分流时柱温设置不合适。或者柱子与溶剂兼容不好也会峰分裂，所以不能一概而论。
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