主题：【讨论】灵芝HPLC指纹图谱方法建立实验设计方案讨论

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老鱼

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发表于：2007/10/29 14:58:00 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

灵芝HPLC指纹图谱方法建立实验设计方案

一、灵芝成分提取方案：

目前研究较多的灵芝化学成分有：三萜类化合物、多糖类、核苷类、甾醇类、生物碱类、呋喃衍生物、氨基酸多肽类、无机元素、脂肪酸等。

提取溶剂与提取方法的选择：

采用无水乙醇、95%乙醇、50%乙醇、甲醇、50%甲醇、氯仿、丙酮等多种溶剂分别进行索氏提取和超声提取，对比索氏提取与超声处理两种提取方法的检测结果，选择最佳的作为最终处理方法。

方案A：索氏提取

1、称取灵芝粉末5g先用5~10倍乙醇回流提取3次，每次2小时，提取液合并浓缩，干燥。提取渣回收乙醇后加水回流提取2次，每次2小时，提取液合并浓缩，干燥。将上述两种提取物混合，以流动相溶解得实验用待测液a1。

（浓缩干燥过程可采用旋转蒸发仪）

2、换用其它溶剂，同上操作，得实验用待测液a2、a3、a4、a5、a6、a7。

方案B：超声提取：

1、称取灵芝粉末5g，以95%乙醇为溶剂超声提取三次，每次30分钟，提取液合并浓缩，干燥。提取物以流动相溶解，得实验用待测液b1。

2、换用其它溶剂，同上操作，得实验用待测液b2、b3、b4、b5、b6、b7。

方案C：（来自文献）

精确称取样品5g，加入甲醇50ml，称重，超声提取45分钟，称重，甲醇补足，摇匀过滤，蒸干，以流动相溶解得实验待测液c。

因甲醇有毒性，且流动相考虑用甲醇-水混合液，因此，在做提取时可以尝试不将其蒸干；或者在浓缩操作中使用旋转蒸发仪回收溶剂。

二、提取方案选择与检测波长

待测样：a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7、b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7、c。

将待测液分别测其三维全息紫外光谱，以选择最佳的提取方案及检测波长。

（实际试验时，先以一种提取方案制得的待测液进行检测以选择合适的提取溶剂，然后以此溶剂换用另外一种提取方案与前一方案进行比较。因此比一定就是上述待测液。）

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2007/10/29 15:05:00 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

三、HPLC实验：

流动相的选择：
试验过程中对比不同的流动相: 甲醇- 水、甲醇- 乙腈- 水、乙腈- 水；如果效果不好再考虑乙腈-0. 5 %醋酸铵溶液、甲醇-0. 5 % 醋酸铵溶液流动相体系。

实验方案1：等度洗脱
色谱条件待定。
流动相暂定为20%甲醇+80%水。检测波长视紫外图谱情况而定。
记录色谱2h。
实验方案2：梯度淋洗（暂定）。

时间/MIN 流速/ML/MIN 甲醇/% 水/%
0 1.0 20 80
15 1.0 40 60
25 1.0 70 30
35 1.0 85 15
60 1.0 100 0
120 1.0 100 0
由于不知灵芝成分的极性如何，因此以梯度淋洗为主要考虑方法。

稳定性试验：

供测试溶液放置3h、6h、12h、24h、48h、72h后再进样, 记录指纹图谱。计算各共有色谱峰的相对保留时间的RSD (%)、相对峰面积的RSD。

（或者依次扫全息紫外图谱？）

（10批次样品处理中间会有时间间隔，很难同时处理这么多批次，如果放置后发生变化，需要处理一批做一批，若不会有明显变化则可以全部药品处理完后统一做其HPLC实验）。

精密度试验（重现性试验）：

供测试溶液连续进样5 次, 记录指纹图谱。计算各共有色谱峰的相对保留时间的RSD (%)、相对峰面积的RSD。

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