主题：【分享】欧盟兽药检测方法（之三十八）

9 分析操作步骤
9.1 提取步骤
9.1.1 血浆
9.1.1.1 血浆样品按照9.2节中描述的那样参和均匀后，与12mL pH=12的缓冲溶液（6.2.1）混合好，装入20mL的带有螺丝帽的试管中。
9.1.1.2 加入6mL乙酸乙酯，在一台往复式振荡器上振荡10分钟。
9.1.1.3 以1600g的离心力离心5分钟。
9.1.1.4 将有机相转移进入一根含有1mL 0.2M硫酸的带有螺丝帽的10mL的试管中。
9.1.1.5 混合物在一台往复式振荡器上振荡10分钟，以1600g的离心力离心5分钟。
9.1.1.6 有机相在真空下蒸发到只剩下水相，然后加入4mL乙酸乙酯和正己烷的混合有机溶剂（2：1，v/v）。
9.1.1.7 混合液做短时间的振荡后，进行低速离心，废弃上层有机相。
9.1.1.8 残留的硫酸相用1mL 2M的氢氧化钠中和后，再用5mL的乙酸乙酯提取。
9.1.1.9 有机相滗入一根10mL的玻璃试管中（7.10），通氮气在40℃水浴上蒸发至干。

9.1.2 组织样品
9.1.2.1 准确称量组织样品后，装进一根含有3mL pH=7的Sorensen缓冲溶液（6.3.2）的20mL玻璃试管中，加入500pg同位素[ ]示踪原子标记的克喘素后，用Polytron均质器（7.2）均质混合1分钟。
9.1.2.2 以1800g离心力离心样品15分钟，上层悬浮液滗入一根带螺丝帽的20mL的试管中。用1mL 2M的氢氧化钠使水相碱化后，加入6mL乙酸乙酯，放在一台往复式振荡器上振荡10分钟。
9.1.2.3 接下去样品按照血浆的提取操作步骤进行提取（9.1.1.3到9.1.1.9）。
9.2 为质量控制进行的添加
9.2.1 血浆样品；每份1mL不含克喘素的人体血浆若干份，各添加50 L浓度为10ng/mL，含有[ ]示踪原子标记的克喘素（作内标用）的水溶液（6.2.5）。每份还要添加不同量的不含示踪原子标记的克喘素，使该血浆样品系列中，克喘素的浓度范围为5 250pg/mL。1mL空白样品中，只添加作内标用的有[ ]示踪原子标记的克喘素。
9.2.2 组织样品；每份0.2g不含克喘素的组织样品若干份，各添加50 L浓度为10ng/mL，含有[ ]示踪原子标记的克喘素（作内标用）的水溶液（6.2.5）。每份还要添加不同量的不含示踪原子标记的克喘素，使该组织样品系列中，克喘素的含量范围为10 500pg/g。0.2g空白样品中，只添加作内标用的有[ ]示踪原子标记的克喘素。
9.3 进行衍生反应。
值得注意的是，为了除去衍生反应试管中的水，试管（7.10）事先用丙酮洗涤，然后放在无水硫酸钠上干燥，丙酮挥发干净后，加入40 L的PFPA，盖
紧试管盖，在室温下放置，直到分析时使用。
9.4 进行GC-MS分析
9.4.1 GC实验条件设置
9.4.1.1 进样体积 1 L衍生反应后的样 品（9.2）
进样温度 290℃
进样方式 移动落针式进样
起始温度 180℃
升温梯度 8℃/min
第一终止温度 230℃
升温梯度 20℃/min
第二终止温度 290℃
9.4.1.2 有[ ]示踪原子标记的克喘素的保留时间是5.22min，无示踪原子标记的克喘素的保留时间是5.16min（数据来自Girault和Fourtillan，1990）。
9.4.2 质谱实验条件设置
离子化：
离子化模式 负离子化学离解
离子化温度 180℃
发射电流 300 A
电子能量 100eV
被监测离子 m/z=368（克喘素）
m/z=377（内标）
反应气体 甲烷，在离子源的压力约0.8T0rr
9.4.3 克喘素含量的测定
克喘素和[ ]克喘素的负离子化学离解的质谱，通过扫描四极杆质量过滤器而被记录下来，每1.1秒扫描一次，扫描质量从250到450。将仪器聚焦在单一离子模式时，可测量m/z368（克喘素的）和m/z377（[ ] 克喘素的）两种离子碎片，从而实现对克喘素含量的测定。每次对质量范围扫描的驻留时间是100毫秒。
9.4.4 克喘素的证实（参看10.1）

10 结果的计算
10.1 校正曲线
用一条线性校正曲线来进行结果的定量计算，该线性曲线是用[ ]克喘素（内标）与标准克喘素的离子强度比，对标准的浓度（例如：pg/进样小瓶）进行最小二乘法而拟合得出的。当然浓度在拟合计算中是一个输入变量。
该线性校正曲线是用7个数据点作出来的（线性相关系数r=0.9998），它离原点的截距几乎是零。血浆的校正曲线每天都能重复，相对标准偏差仅为4 （数据来自Girault和Fourtillan的报告，1990）。
10.2 回收率
提取回收率约为80 ，但通过使用[ ]克喘素作内标，，可以使所有的变动性大为降低。。
10.3 准确度与精密度
方法的精密度是由Girault和Fourtillan进行测量的（1990），组织和血浆样品的精密度实验结果列出在表1中。
表1
样品 理论浓度 n 观察浓度 SD CV 误差
名称 （pg/mL 的平均值 （ ） （ ）
或g） （pg/mL
或g）
血浆 200 10 196.3 5.89 3.0 -1.9
100 5 99.3 3.41 3.4 -0.7
20 5 20.0 0.74 3.7 +0.2
5 10 4.8 0.61 12.8 -4.3
组织 200 10 212.7 15.6 7.3 +6.4
（肾） 20 10 18.9 1.7 9.0 -5,5

10.4 证实或确认
为了证实至少可以同时测定出4种离子的响应比，必须要对标准物和未知样品的实验数据都进行计算才行。
一氟化乙基衍生离子的质量表示如下：
M.W M.WD. -----------离子----------
克喘素 276 404 368 297 312 350 404
-FPA
[ ]克 285 413 377 297 313 359 413
喘素-FPA
M.W = 纯化合物的分子量。
M.WD = 衍生化反应后的分子量。
根据欧共体标准（EC-criteria）的要求， 至少有4 种离子要进行监控。每一种离子的响应值，其最大值应该达到至少超过平均噪音的 3倍标准偏差（ 3D）的要求。如果达到了这一标准，全部被监控的离子就可以按照3种不同的比率来进行计算。对标准分析物来说，在相应的浓度范围内，更适合以相同的比率来进行计算。对鉴定为阳性反应的未知样品，应该要求它们的响应值，全部落在标准物响应平均值的 10 的范围内。
注意：由于MS-设备经常发生波动，因此无法保证严格执行此标准。鉴于此，可以用一种考虑了实验波动性的标准来替代此标准。替代标准中未知样品的响应值比率，应该是相应标准物响应值比率 3倍标准偏差范围内。
11 特殊情况
12 关于实验操作的注意事项
13 质量控制，标准物质，参考物质和抗体
14 实验报告
15 缩略语表
一份重要的缩略语表给出在附件I的第12节。



16实验操作流程图


Cy 2.3 -激动剂 一种用GC-MS正离子化学离解模式三甲基硅烷化衍生处理确认和测定牛尿中 -激动剂方法

1 范围
该分析方法描述了如何确认小牛和成年牛的尿样中存在单体 -激动剂的实验操作。该分析方法是法兰西官方方法，与欧洲经济共同体残留导则（86/469/EEC）一致。

2 应用领域
该方法是为了确认在对小牛和成年牛的尿样进行 -激动剂的筛选实验中发现为阳性结果的方法。该方法用于对存在下列 -激动剂残留的确认：clenbuterol, clenpenterol, hydroxymethyl-clenbuterol, salbutamol, terbutaline, cimaterol, cimbuterol, mabuterol, mapenterol, tulobuterol, fenoterol 及 ractopamine等。
检测限定义为浓度低于1 g/L时的信躁比要 3。意识到该方法是专门用于确认已经怀疑存在某种 -激动剂的残留这一点是非常重要的。如此就可以使分析操作瞄准某个特定GC保留时间和特定质谱的化合物。

3 参考资料（略）

4 定义
-激动剂的含量是指被测定样品中 -激动剂的物质的量，根据以上对本方法所作的描述，它应该表述为 g/kg样品或 g/L样品。

5 方法原理
本方法由6个部分组成。
⑴ 共轭物的水解
⑵ 甲醇沉降处理（任选），特别适合成年牛的脏尿处理。
⑶ 用混合固相提取（SPE）色谱法对提取物进行纯化和浓缩。
⑷ 衍生反应。
⑸ 以甲烷为反应气体用正离子化学离解模式进行GC-MS测定。
⑹ 结果的计算和评价。

6 实验材料
注意：反应试剂（包括仪器设备）的来源都应该符合要求，不过不同来源的试剂和设备只有等效才可使用。全部试剂都必须分析纯或高于分析纯。
6.1 参考化合物和标准物质
6.1.1实验中使用了下列标准物质：
氯化克喘素（法兰西Interchim， Montlucon公司）
Salbutamol hemisulphate, Terbutaline hemisulphate, metoprolol tartrate 和meterproterenol hemisulphate（西格玛公司）。
Cimaterol, Clenpenterol（NBA 760）, mabuterol, fenoterol hydrobromide 和hydroxymethyl clenbuterol（NA1141）（Boehringer Ingleheim公司）。
Tulobuterol hydrochloride（Abbott公司）。
Ractopamine hydrochloride（Eli Lilly公司）。
Cimbuterol和marpenterol 由法兰西Rennes大学化学系合成。
同位素示踪原子标记的内标物质，克喘素-d6和salbutamol-d6，由RIKILT,Wageningen, The Netherlands等人赠送。有一点应该预见到，上述的参考化合物必须经过DGXII检验程序的检验和测量才可以使用。
6.2 化学药品和试剂
6.2.1 Helix pomatia果汁（ -glucuronidase-arylsulfatase, Merck-4114）。
6.2.2 冰乙酸（Panreac-131008或Merck-62）。
6.2.3 超纯水（ 14 M ．cm）。
6.2.4 甲醇（Carlo-Erba RS CLHP-412002或Merck-6009）。
6.2.5 乙酸乙酯（Merck ZA-9623）。
6.2.6 32 的氢氧化铵（Merck 5426）。
6.2.7 1 M氢氧化钾（Merck ZA-9018920）。
6.2.8 1 M乙酸。
6.2.9 N-O-双-（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）（Regisil-270111或FLUKA-15244）。
6.2.10 甲苯分子筛（Fluka-89677）。
6.2.11 乙酸钠（Merck ZA-6268）。
6.2.12 磷酸二氢钾（Merck ZA-4873）。
6.2.13 氮气（通过硅胶干燥）。
6.2.14 高纯氦气（NSS,Carboxyque）。
6.2.15 高纯甲烷气（N55,Carboxyque）。
6.3 溶液
6.3.1 -激动剂：以甲醇为溶剂制备标准储备溶液，浓度分别为1g/L和100 g/L（6.1.1），在-18℃贮存。
6.3.2 -激动剂：以甲醇为溶剂稀释标准储备溶液（6.3.1）以制备标准工作溶液，浓度分别为10 g/L和1 g/L，在-18℃贮存。
6.3.3 2M pH=5.2乙酸钠缓冲溶液，用于共轭物的水解。制备操作为溶解164g乙酸钠（6.2.11）于900mL水中（6.2.3）用冰乙酸（6.2.2）调节pH到5.2 0.1，最后用水稀释到1L，在+4℃贮存，使用期为1个月。
6.3.4 pH=6，0.1M的磷酸盐缓冲溶液。溶解13.6 0.1g磷酸氢二钾（6.2.12）于900mL水中（6.2.3），用1M的氢氧化钾（6.2.7）调节pH值到6.0 0.1，最后用水稀释到1L，在+4℃贮存，使用期为1个月。
6.3.5 以97：3（v/v）混合乙酸乙酯和32 的氢氧化铵。每100mL用于16个样品。使用前搅拌或摇动，并且在后面的9.13.3步操作期间，同时接受超声波水浴的处理。