生物样品或动物饲料中β-激动剂的检测和确证方法(EEC, 确证法)
β-Agonists – A Method for the Detection and Identification ofβ-Agonists in Biological Samples and Animal Feed
(EEC, Cy 2.1 Confirming Method)
1.主题内容
此分析方法,描述了残留在动物源样品和动物饲料中,单个β-激动剂的检测和确证试验。此方法主要用于测试克喘素和舒喘灵。这项工作,是按照欧洲经济共同体药物残留导则(86/468/EEC)进行的。
2.应用范围
此方法用于日常筛分和确证分析,样品为来自小公牛、黄牛和猪的尿和肝,还有动物饲料样品。日常测试的药物残留包括克喘素、舒喘灵、特普他林,cimaterol,mabuterol,原则上还适用于叔丁基或异丙基B-激动剂,例如脲喘宁,pirbuterol,tulobuterol等。检测低限被定义为空白测定标准偏差的三倍,在进行化合物初始筛分试验时要小于1μg/kg或μg/L.按照EC标准检验方法,确证实验的检测限取决于所用的电离技术和设备,检测限为0.5-1.5μg/kg(L)。
3. 参考资料(略)
4. 定义
-激动剂的含量是指被测定样品中 -激动剂的残留量,根据以上对本方法所作的描述,表示为 g/kg或 g/L。
5.方法提要
本方法由四部分组成。
(1)提取物的制备。
(2)用免役亲合力色谱法净化提取物并浓缩。
(3)用GC-MS法进行测定。
(4)结果计算和评价。
6.试剂
6.1 化学药品和试剂。
6.1.1 标准品。
被使用的标准化合物如下:
名称 美国化学文摘登录号 分子式 分子量
克喘素 37148-27-9 C12H18Cl2N2O 277.18
舒喘灵 18559-94-9 C13H21NO3 239.31
特普他林 23031-25-6 C12H19NO3 235.29
雪马特罗 54239-37-1 C12H17N3O 219.29
马本特罗 56341-08-3 C13H18ClF3N2O 310.75
如果想要的话,还能列出一些 -激动剂。
应该优先使用同位素标记的内标,例如克喘素-d6,舒喘灵-d6或克喘素-37Cl2.估计这些标准品可以通过BCR买到。
6.1.2 免役亲合力色谱(IAC)-实验材料的制备
制备中使用的免疫原,按照早期描述的方法进行制备,即通过diazonium-clenbuterol偶合后与牛血清蛋白作用,还有diazonium-cimaterol偶合后与牛血清蛋白作用(BSA,由 ,Yamamoto等人发表的方法,1982)。各自获得的的抗血清(免疫原)被用来制备免役亲合力色谱(IAC)材料,具体做法是用免疫原给兔子进行4次免疫试验,每次使用2mg的免疫原,整个免疫周期为5个多月。免疫实验获得的抗血清免疫球蛋白-G(IgG)抗体,要与被其偶合并被激活了的免疫原进行分离,分离方法为早期Ginkel等人所描述的方法(1989年)。最后获得的抗体色谱柱( IAC柱或免役亲合力色谱柱),作用于6.1.1中所提到的那些兽药时的柱容量,应大于100 ng.
6.1.3 乙醇
6.1.4 甲醇
6.1.5 甲苯
6.1.6 乙腈
6.1.7 二氯甲烷
6.1.8 盐酸
6.1.9 乙酸乙酯
6.1.10 乙酸
6.1.11 乙酸纳
6.1.12 氯化纳
6.1.13 Extrelut
6.1.14 乙酸盐缓冲液:0.1mol/L,pH4.0
取4.92g乙酸(6.1.10)溶于800 mL水,加2.45g乙酸纳(6.1.11)和29.25g氯化纳(6.1.12)。调节pH值到4.0 0.1,最后加水到1000mL。
6.1.15 免役亲合力色谱柱(IAC) 洗脱缓冲液:
取400mL乙醇(6.1.3)加75mL水和25mL乙酸缓冲液(6.1.14)
6.1.16 磷酸氢二钠
6.1.17 磷酸二氢钾
6.1.18 磷酸盐缓冲液:0.02 mol/L,pH=7.0
溶解2.278g磷酸氢二钠(6.1.16),0.416g磷酸二氢钾(6.1.17)和9.09g氯化纳(6.1.12)于800mL水中。调节pH值为7.0 0.1,最后加水到1000mL。
6.1.19 标准物质储备溶液:用乙醇配制浓度为1g/L,于-20℃避光保存。
6.1.20 标准物质工作溶液:用乙醇配制浓度为0.01g/L,于+4℃保存,最长保存周期两周。
6.1.21 衍生化试剂:N2O-双(三甲基硅基)-三氟乙酸铵(BSTFA)含1%三甲基硅烷TMS(Pierce,art.no.38832)
6.1.22 -葡萄苷酸酶/或其磷酸酯酶(suc’Helix Pomatia,每毫升含有100000单位 -葡萄苷酸酶和1百万单位的磷酸酯酶,Industrie Biologique,法兰西,IBR代码213473)。
7. 设备
7.1 圆底玻璃烧瓶,150mL(Corex,art.no.8422-A)。
7.2 巴氏消毒玻璃毛细移液器。
7.3 自动移液器(Gilson P20, P200, P1000, 和P5000)。
7.4 冷冻离心机(RC-3, Sorvall)。
7.5 台式离心机(GLC-4, Sorvall)
7.6 玻璃离心管(55mm ×11.5mm)(Renes, RB55)
7.7 电热温控水浴锅,并配备吹氮气设施,温度可控制在50±2℃(Gfl, Salm & Kipp)。
7.8 涡旋混匀器(Vortes-genic, Wilton & Co)。
7.9 超声波水浴(Bransonic 32)。
7.10 衍生用玻璃小瓶:(小瓶规格为chromacol 250(A),瓶盖规格为chromacol 85c, 密封垫规格为chromacol 8-ST15 )。
7.11 培养箱:60℃(Sealvis)。
7.12 加热型衍生用玻璃小瓶(Pierce no, 18790):并排、并配有通氮气设施。
7.13 进样用小玻璃瓶(Chrompack art.no.10201):配有玻璃插入孔(Chrompack art.no.10381)。
7.14 铝盖(Chrompack art.no.10210)。
7.15
气质联用仪(GC-MS)。
7.15.1
气质联用的
气相色谱仪(惠普5890)。
7.15.2 自动进样器(惠普7637A)。
7.15.3 质谱选择性检测器(惠普5970)。
7.15.4 工作站(惠普59970)。
7.15.5 打印机(惠普think yet)。
7.15.6 键合型硅烷
气相色谱柱:SE-52,25m×0.25mm ID,膜厚0.25μm(Mechery-Nagel,art.no.723054)。
7.15.7 带水浴的旋转蒸发器,水浴温度 40±0.2℃。
8. 样品及取样程序
N.B. 留意6.3.1节和国际标准化组织文件78/2-1982(E)以及由文件2052/Ⅵ/84-EN的附件Ⅱ导出的下列通则。
8.1 样品的性质
必须符合导则64/433/EEC中定义的内容,因此能够进行肉样中残留物的测定。如没有符合要求的样品生物体液或粪便可以指定为样品。
8.2 样品量
样品量要大到足以完成方法以及重复测定的要求。本方法测定β-激动素作一次测定时所要求的样品量为:肝3g,尿10mL,动物饲料10g。
8.3 样品采集和包装的方法
必须使实验室易于鉴别和使用。
8.4 样品的包装、贮存和运输的方法
必须保证样品的完整性,不能影响测试的结果。做 -激动素分析的样品,必须在低于-18℃的温度下贮存和输送,饲料样品可以在+4℃的温度下输送。