主题:【已应助】【求助】标准曲线线性不好,急

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sunxiaoping2005
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我现在正在做生物样本的浓度检测,所用仪器是菲尼根的半定量质谱检测仪器,血浆处理方法是甲醇沉淀蛋白后进样。进了两套标准曲线,一套是在空白血浆中的标准曲线,一套是刚配制好的标准溶液,但是每一套标准曲线都不好,曲线一共设置8个点,前5个点的线性非常好,但是低浓度的三个点已经重复了好几遍了,其响应与浓度没有任何关系,比例关系也比较乱,检测过程中是加了内标的,而且内标的响应也一致,没有较大变化。还有,最低血浆浓度设在800ng/ml,实际进样浓度稀释5倍。请各位同仁指点下我怎么来分析原因,及可能采取的措施呢。
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zhufangwei
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我现在正在做生物样本的浓度检测,所用仪器是菲尼根的半定量质谱检测仪器,血浆处理方法是甲醇沉淀蛋白后进样。进了两套标准曲线,一套是在空白血浆中的标准曲线,一套是刚配制好的标准溶液,但是每一套标准曲线都不好,曲线一共设置8个点,前5个点的线性非常好,但是低浓度的三个点已经重复了好几遍了,其响应与浓度没有任何关系,比例关系也比较乱,检测过程中是加了内标的,而且内标的响应也一致,没有较大变化。还有,最低血浆浓度设在800ng/ml,实际进样浓度稀释5倍。请各位同仁指点下我怎么来分析原因,及可能采取的措施呢。


后面点的浓度是不是太高了不在线性范围内,你说前面5个点线性很好,后面又说低浓度三个点响应与浓度没有任何关系,不太明白,曲线把高浓度去掉几个,标准曲线6个点够了。你最低血浆浓度800ng/mL,你不觉得很高吗,那你最高血浆浓度又是多少呢,液质是ppb级别的,浓度高了当然线性不好。
dickwang2008
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我现在正在做生物样本的浓度检测,所用仪器是菲尼根的半定量质谱检测仪器,血浆处理方法是甲醇沉淀蛋白后进样。进了两套标准曲线,一套是在空白血浆中的标准曲线,一套是刚配制好的标准溶液,但是每一套标准曲线都不好,曲线一共设置8个点,前5个点的线性非常好,但是低浓度的三个点已经重复了好几遍了,其响应与浓度没有任何关系,比例关系也比较乱,检测过程中是加了内标的,而且内标的响应也一致,没有较大变化。还有,最低血浆浓度设在800ng/ml,实际进样浓度稀释5倍。请各位同仁指点下我怎么来分析原因,及可能采取的措施呢。


请将问题说的详细点,楼上指出的很正确!我也是看你描述的前后有矛盾。
sunxiaoping2005
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我说的实际问题是标准曲线高浓度区域的五个点线性较好,但是低浓度区域的三个点线性不好,事实上我试过的血浆浓度从15ng/ml到100μg/ml,浓度倍数关系是2倍,具体方法是将标准溶液依次按5倍浓度等比稀释,取100微升空白血浆,分别取10、20微升稀释后的标准品系列稀释浓度,这样血浆浓度是按照2.5倍关系等比下降。血浆处理采用400微升甲醇沉淀蛋白,进样体积5微升。结果是12个浓度系列中高浓度区域5个点线性良好,但是低浓度区域的峰面积比不成比例增加,没有什么规律,总体来说低浓度区域的点较整条标线,浓度偏高。但单独将低浓度区域的点做标准曲线时,线性仍然不好,回算后每点浓度的准确度也较差。
sunxiaoping2005
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昨天有重新做了一套标线,把混标单独配,稀释后加入到空白血浆中,系列的浓度和之前的是一样的,这样线性比较好了,但是浓度最小的点还是在线性外,准确度非常不好,而且期间进样的时候出了一个奇怪的问题,就是同一浓度的样本先后进了两针,结果标准品的峰面积相差2倍,将峰面积与内标峰面积相比,两次进样的峰面积比值也相差较大,如1.3和1.5,现在也无法解决这个问题,所以决定把柱子洗了重新进,不知道这样会不会好,结果等待中
lankywang
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zzz
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我觉得你的浓度比较高,你有没有测试过化合物是不是有吸附?我觉得吸附的可能性比较大!
peterhello
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我说的实际问题是标准曲线高浓度区域的五个点线性较好,但是低浓度区域的三个点线性不好,事实上我试过的血浆浓度从15ng/ml到100μg/ml,浓度倍数关系是2倍,具体方法是将标准溶液依次按5倍浓度等比稀释,取100微升空白血浆,分别取10、20微升稀释后的标准品系列稀释浓度,这样血浆浓度是按照2.5倍关系等比下降。血浆处理采用400微升甲醇沉淀蛋白,进样体积5微升。结果是12个浓度系列中高浓度区域5个点线性良好,但是低浓度区域的峰面积比不成比例增加,没有什么规律,总体来说低浓度区域的点较整条标线,浓度偏高。但单独将低浓度区域的点做标准曲线时,线性仍然不好,回算后每点浓度的准确度也较差。

1.用空白血浆配置一个最高浓度的点,然后用空白血浆依次稀释下去。取10,20ul配置的误差会很大的
2.LC-MS低浓度线性不好是很常见的问题,蛋白沉淀会引入较多的基体杂质,可以考虑液液萃取等更加好的净化提取方法。
3.标准曲线使用加权最小二乘法,1/X或者1/X^2为权重系数进行线性回归,这样可以低浓度可以获得更好的准确度。
sunxiaoping2005
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质谱是四级杆,采用方法是MS/MS,SRM,昨天有试了一套标准曲线,两个标准品单独稀释后与血浆混合,其中一个标准品的线性很好,而另一个标准曲线线性不好,最低浓度偏高,这样加权法就用不上了。今天进样时又突然发现进样针松动,里面的弹簧坏了,拿别的弹簧替换了,还不知道今天下午的结果会不会好一些。
另,由于我需要检测的物质是水溶性的,在纯甲醇或乙腈中反而不容,所以现在只能用甲醇沉淀,这样结果还稳定些。
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