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液相色谱（LC）

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主题：【液相色谱及液质联用版面联合讲座落幕】－－－液质联用之液相部分整理帖

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〓猪哥哥〓

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发表于：2009/04/28 09:45:14 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

该帖子已被03yx2设置为精华；

【液相色谱及液质联用版面联合讲座落幕】－－－液质联用之液相部分详解
【[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p]液相色谱及液质联用版面联合讲座】－－－液质联用之质谱部分详解[/URL]
在此感谢液相及液质联用版主和专家的辛苦劳动和鼎力支持！

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2009/4/28 9:47:42 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

板油提问：

1、液相定性以保留时间为基准，但同一个时间可以出现很多种物质，该怎样对其准确判断(ionbaby)
2、我在做牛磺酸分析时，为什么峰面积差的特别多。改变流动相的比例，峰面积就差得很多。(bigsea110)
3、自动进样由于管路增加等因素，相同情况下比用注射器进样柱效下降5％一10％左右，但可自动进行取样、进样、清洗等一系列操作，操作者只须将样品按顺序装入贮样装置即可，操作简便、重复性好。解释（lxj1206）
4、HPLC为什么会有死时间峰？(jdg1128)
5、检测器的感应器是怎么个说法？又有那些因素影响？（wufengdeyun）
6、我对waters2695中的在线脱气机工作原理和其结构不了解，望详细解释一下工作原理和结构，十分感谢！(lcc0529)
7、样品经过色谱柱分离后，只能通过保留时间来定性，如果我想把分离出来的组分进行GC-MS分析定性（因为我们没有液相质谱），是否可以？如果可以在操作上遇到了问题，就是我从出峰到样品流出的间隔时间是多少，我怎么样才能接到分离出我想要的组分？(huahua4yue1)
8、长期使用分析纯的甲醇对仪器有没有损害？色谱纯的太贵了。我们分析的样品基本上没有浓度特别低的。(tianzhen)
9、蒸发光散射检测器中有一个NOISE FILTER，它的单位为什么是秒，它是用来消除哪一部分NOISE的？它的工作原理或过程是什么？
谢谢！(tianzhen)
10、请例举HPLC在环境污染物分析中的应用，请至少写出五种物质。（guthouyizh07)
11、色谱柱填料的极性、流动相的极性以及待测物质极性之间究竟又怎样的关系？
这三者该怎样组合才能得到好的分离度与灵敏度？(sunpoppy2004)
12、想请问一下版主，对于初学者可不可以从原理入手，再学习操作过程，再学习注意事项，再学习维护？谢谢版主提供了这样一个学习的机会。版主辛苦了。(ningxiangpyw)
13、我们单位在检测三聚氰胺样品时候，采用的是液相色谱法，原来做出的标准品的峰很漂亮，但是换流动相和柱子（流动相和柱子都是跟原来的一样，pH=3.3 10mM庚烷磺酸钠930/乙腈70；色谱柱是Venusil ASB-C18 4.6*250mm*5μm）后做出的标准分成了两个峰，这是什么原因造成的?该如何解决？谢谢(houxiaodong2000)
14、各位专家版主：本人不是分析专业出身，接触仪器也就是大半年的时间，有三个问题想请教一下。第一，我在用LCMS时，有时结果的基线非常高，我除了想到是缓冲液的问题外，没有别的想法，我想请问有没有还有其他的原因。第二，机器有没有一个连续使用的时间界限，是不是过长时间（比如24小时）的连续使用会对分析结果有影响。第三，我用的是日本岛津的高端生物质谱 LC-IT-TOF，由于操作系统与说明书都是日文的（本人只会英文），所以除了正常操作外，其他的功能并不清楚，我想请教一下熟悉此机器的大虾，这个机器能不能只检测大于双电荷的离子，也就是不检测单电荷离子。问题有些多，谢谢大家！(geae)
15、液相色谱只能通过保留时间来定性，但是我们的LC同一种标样，在同样的条件下每天检测保留时间都不同，那么是不是每天在检测样品前、检测样品中都要检测一下标样来定性呢？需不需要每天都做校准曲线来定量。另：保留时间偏离是否和每天更换新的流动相有关系呢？保留时间偏离多少我们认为这不是目标物。谢谢我对液相的使用还不是很了解。(yolk)
16、见附件的图谱，请问图谱有没有问题，目标物是否算分离出来，怎样使目标物前后的峰分离的更好。(yolk)
17、我是一个刚刚接触色谱分析不久的新人，我们这里的仪器测出的保留总是不怎么稳定，而且每次检测出的峰面积误差也很大，请问是什么原因，有什么办法可以控制的。(lanvin)

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2009/4/28 9:53:05 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

提问及解答

1、液相定性以保留时间为基准，但同一个时间可以出现很多种
物质，该怎样对其准确判断(ionbaby)
色谱确实存在这样的缺陷，如果你觉得有疑问，只能同过质谱，没有质谱还可以通过改变流动相、色谱柱来进一步验证。另外还可以用现在的PDA检测的3D图可以做对照，光谱图做对比等多种渠道进行解决。
不知道你用的什么检测器,如果是DAD的话,可以跟标准的光谱图对比来定性的.
你可以用加大峰方法来比较。
可以选择不同的波长进行分析，如果您事DAD的话那会更好一些，看看这一时间段出来的物质是不是跟你想要的物质的光谱图一样，如果一样的话也只能说明有可能是你所要分析的物质，用质谱辨别后才能完全肯定是不是你需要分析的物质。
液相目前基本上是以保留时间定性的，这是液相的劣势。但是它可以测定难挥发性和热不稳定性的物质，这类物质在总的化合物中大约占70～80%。
在特定情况下可以做判定依据，一般情况下需要多种方法结合才能确定在重复性条件下，保留时间相同是同一物质，或单峰是纯物质，这些方法有气相、气质、液质，甚至是核磁共振法。
通过改变流动相和色谱柱可以进行进一步地验证，但用质谱或PDA检测来进行确定时需要先保证样品中的所有组分完全分离，或者说你要确定的色谱峰是单一的纯组分。

2、我在做牛磺酸分析时，为什么峰面积差的特别多。改变流动相的比例，峰面积就差得很多。(bigsea110)
改变流动相的比例，峰面积会差，差多差少跟被测组分的洗脱性有关系
一般都要配置质谱或者DAD多波长检测器来定性。通过物性的不同，把不同的物质更好的分离。
通过换不同的流动相种类或比例，有时不同的PH值影响也非常大，加入离子对等办法。如果还不行的话，就要看看是不是需要换另外种类的柱子来做了。如果可以的话，在前处理的时候精制一下。

3、自动进样由于管路增加等因素，相同情况下比用注射器进样柱效下降5％一10％左右，但可自动进行取样、进样、清洗等一系列操作，操作者只须将样品按顺序装入贮样装置即可，操作简便、重复性好。解释（lxj1206）
自动进样器比手动多的管路就只有进样针和计量泵的体积，也就是增加了管路的死体积，死体积会影响到柱效，在色谱图上看的话色谱峰会变宽。
柱外体积的影响, 样品在管路增加的体积里面纵向扩散引起峰展宽,从而柱效下降.

4、HPLC为什么会有死时间峰？(jdg1128)
由于管路不会做的百分百的没有空隙。所以死体积是一直存在的。通常是通过溶剂峰来确定死时间。你所说的死时间峰就是溶剂峰。你可以通过进空白样品来确定溶剂峰，一般在5min之内出峰
从样品进入到检测起之间仪器本身的体积叫死体积，纯流动相流过这一段体积是需要一段时间的，这段时间就是死时间。如果是在走纯的流动相的时候有峰出现那就应该是鬼峰了，可能是由于系统哪个部件污染或者系统有残留等产生的。
没听过什么死时间峰
在液相色谱中的死体积应该是色谱柱内填料颗粒间隙和从进样到检测期间色谱柱外管路及连接部分的空间总和。流动相通过这一路径到达检测器所需要的时间被称为死时间。现在随着色谱柱技术的不断提高，色谱柱填料颗粒的粒径越来越小，色谱柱的柱效越来越高，色谱柱的长度会越来越短，特别是超高效液相色谱的出现，由外流路产生的死体积所占的比例将越来越大，可能将会成为死体积的主要部分。
死时间峰的出现大多可能是溶剂峰或进样阀切换时所产生的吸收峰。
对于反相色谱而言,死时间的测量需要用到与固定相几乎不保留的物质(离子化)尿嘧啶苯黄酸等物质,所测得死时间峰要比溶剂峰提前好多.

5、检测器的感应器是怎么个说法？又有那些因素影响？（wufengdeyun）
加拿泵的压力感应器来说吧。系统压力为50bar，但是在工作站中显示为100bar，这就是压力感应器出问题。检测器感应出现问题响应值的灵敏度就下降，一般感应器出问题较少。有时电压不稳，使用时间过长等因素会导致这样的问题。
影响因素应该有样品的干净程度，流动相的质量等

6、各专家版主：我有一个关于仪器结构和工作原理的问题，问题如下
我对waters2695中的在线脱气机工作原理和其结构不了解，望详细解释一下工作原理和结构，十分感谢！(lcc0529)
可以参考：
话说安捷伦的脱气机
http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20090318/1793322/
Agilent 脱气机维修整理
http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20090319/1794295/
维修脱气机图解
http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20090320/1796946/

7、各专家版主：我有一个关于仪器结构和工作原理的问题，问题如：
样品经过色谱柱分离后，只能通过保留时间来定性，如果我想把分离出来的组分进行GC-MS分析定性（因为我们没有液相质谱），是否可以？如果可以在操作上遇到了问题，就是我从出峰到样品流出的间隔时间是多少，我怎么样才能接到分离出我想要的组分？(huahua4yue1)
似乎这样的说法不恰当“样品经过色谱柱分离后，只能通过保留时间来定性”
液质联用之后可以用质谱来定性的（相同的保留时间）！
可以的，不过溶剂你还要转成上GC的，你可以接收出峰前一分钟接受，出完峰后一分钟的留出液

8、请教两个问题:
1、长期使用分析纯的甲醇对仪器有没有损害？色谱纯的太贵了。我们分析的样品基本上没有浓度特别低的。
2、蒸发光散射检测器中有一个NOISE FILTER，它的单位为什么是秒，它是用来消除哪一部分NOISE的？它的工作原理或过程是什么？
谢谢！(tianzhen)
溶剂没有处理好的话主动阀过滤垫更换的频率增加，石墨密封垫更换的频率也增加甚至可能会磨损泵的活塞干，pergue阀的过滤小白头更换的频率也将增大，严重的可能脏的东西在柱头累积破坏柱子降低柱效，也可能出现鬼峰，基线不稳，压力波动等
分析纯的甲醇对仪器有一定得危害。我上次就看到有人用过了，不宜长期使用。否则仪器，柱子很容易就堵塞。色谱甲醇也不贵，十多块左右。

9、上次去考试考了这么一道题，请例举HPLC在环境污染物分析中的应用，请至少写出五种物质。
晕啊，我当时写不出来。（guthouyizh07)
HPLC已在环境监测中得到广泛应用,特别适用于分子量大、挥发性低、热稳定性差的有机污染物的分离和分析如多环芳烃、酚类、多环联苯、邻苯二甲酸酯类、联苯胺类、阴离子表面活性剂有机农药、除草剂等

10、我有问题请教，请专家指点。
色谱柱填料的极性、流动相的极性以及待测物质极性之间究竟又怎样的关系？
这三者该怎样组合才能得到好的分离度与灵敏度？
谢谢！(sunpoppy2004)
样品中被分离组分的性质与固定相越接近，相互作用就越大，保留时间就越长；与流动相的性质越接近，就越容易洗脱，保留时间就越短。所以说应根据分离分析样品的要求来选择好分离条件。分析的灵敏度则主要是与选用的检测器有关。
一般选择的是分离样品的性质与固定相性质接近的。如反相色谱分离的主要适合极性小和中等极性的样品，对于极性比较大的样品，一般选择正相色谱来分析，如氨基柱，氰基柱等。

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2009/4/28 9:54:28 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

11、想请问一下版主，对于初学者可不可以从原理入手，再学习操作过程，再学习注意事项，再学习维护？
谢谢版主提供了这样一个学习的机会。版主辛苦了。(ningxiangpyw)
最好是先学习下原理，但有时候并没有那么多时间来学习，有的时候顺序是先和别人学习操作和注意事项，然后自己再慢慢学习理论知识。其实这也不是不好的方式，先大致了解了仪器的机构和使用，以后学习理论也非常的带劲。关键时要多和别人沟通和交流。

12、各专家版主：我有一个关于仪器结构和工作原理的问题，问题如下：
我们单位在检测三聚氰胺样品时候，采用的是液相色谱法，原来做出的标准品的峰很漂亮，但是换流动相和柱子（流动相和柱子都是跟原来的一样，pH=3.3 10mM庚烷磺酸钠930/乙腈70；色谱柱是Venusil ASB-C18 4.6*250mm*5μm）后做出的标准分成了两个峰，这是什么原因造成的?该如何解决？谢谢(houxiaodong2000)
是对照品出现了两个峰吗？
样品是否稳定，柱子时候有残留。
发一张图谱来看看。
主要还是柱子的原因，虽然是同一类型的，但是生产批次不一样效果会不一样

13、各位专家版主：本人不是分析专业出身，接触仪器也就是大半年的时间，有三个问题想请教一下。第一，我在用LCMS时，有时结果的基线非常高，我除了想到是缓冲液的问题外，没有别的想法，我想请问有没有还有其他的原因。第二，机器有没有一个连续使用的时间界限，是不是过长时间（比如24小时）的连续使用会对分析结果有影响。第三，我用的是日本岛津的高端生物质谱 LC-IT-TOF，由于操作系统与说明书都是日文的（本人只会英文），所以除了正常操作外，其他的功能并不清楚，我想请教一下熟悉此机器的大虾，这个机器能不能只检测大于双电荷的离子，也就是不检测单电荷离子。问题有些多，谢谢大家！(geae)
1.基线非常高除了跟流动相有关系外还和你走梯度、检测器比色池是否污染等有关系。
2.一次开机的时间问题原来版内有个帖子液相仪器工作一次的时间，你可以看一下，这也跟你测定的样品有关系。
基线漂移的原因很多，可以参考：http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20081119/1595388/
液相工作时间可以很长，一个月连续工作都可以，关键是柱子要保证没有残留，一般做一段时间后维护一下，再接着做。

14、各专家版主：我有一个关于仪器结构和工作原理的问题，问题如下：
液相色谱只能通过保留时间来定性，但是我们的LC同一种标样，在同样的条件下每天检测保留时间都不同，那么是不是每天在检测样品前、检测样品中都要检测一下标样来定性呢？需不需要每天都做校准曲线来定量。
另：保留时间偏离是否和每天更换新的流动相有关系呢？保留时间偏离多少我们认为这不是目标物。
谢谢我对液相的使用还不是很了解。(yolk)
就是一瓶流动相，时间长了目标峰的保留时间都会漂移，成熟的方法，只要是一样的流动相，就算新配的也不用每次都做标准曲线，进一个点的标准确认保留时间和峰面积正常就可以
不需要，在确定方法后，更换新流动相做一次即可。不过做含测的时候我们在进样前后都进2针对照品。
保留时间偏离和每天更换新的流动相是有关系的，所以最好一次配制的时候，量大些。一般保留时间的RSD＜2%就可以。

15、各专家版主：我有一个关于仪器结构和工作原理的问题，问题如下：
见附件的图谱，请问图谱有没有问题，目标物是否算分离出来，怎样使目标物前后的峰分离的更好。
（检测的是多菌灵）
流动相：甲醇—水（40+60，v/v）
流速：1.0mL/min
检测波长：281nm
进样量：10uL
柱温：室温
--------------------------------------------------------------------
你目标物质的含量比较小，并且分离度都不好。但是目标物质附近的干扰相对比较少。建议用梯度来做。把起始的比例调高些。
样品物质的最大吸收波长是281吗？最好选择最大吸收。(yolk)
样品复杂，出峰过快，你的色谱图不怎么好，因为基线还没下来，基线在下降，你可以降低甲醇比例，到基线平稳的时候出峰比较好。流动相微小的变化会引起保留时间的变化，而且一个流动相系统压力变了保留时间也会变

16、各位专家版主：我是一个刚刚接触色谱分析不久的新人，我们这里的仪器测出的保留总是不怎么稳定，而且每次检测出的峰面积误差也很大，请问是什么原因，有什么办法可以控制的。(lanvin)
仪器的稳定性跟仪器性能有关系，你能做的就是保证系统压力、检测器等稳定，涉及的知识也很多，包括你说的资料，建议你在版面内下载《色谱技术丛书》学习下
你可以一次走的时间长一些，一次就把分析的样品检测完。这样可以减少波动。
也不一定保留时间完全一样，t的rsd在1%，A在5%就可以。
当然如果峰面积越来越大，说明样品有残留，应大比例有机相冲洗一下。还有就是样品的稳定性不好，或溶解样品挥发。

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