主题：【第三届原创参赛】掰掰我的一次凝胶过滤层析初步分离金属硫蛋白

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大家好，我是凝胶色谱一名新手，以前常常在咱们论坛中学习和下载资料，看到论坛中轰轰烈烈的第三届原创大赛开始了，还有各位达人们的攻略、帮助，心里有点小激动呢~~~于是就拿出自己的一些实验和研究的东东来与大家分享！！说实话拿出来有点小担心，毕竟自己的水平不高拿出来有点献丑了！本着分享第一荣誉第二的原则，就硬着头皮绣出来了！！也希望大家轻拍哦！

===================================Show Time========================================

        我在本次试验中研究的是金属硫蛋白(Metallothionein, MT)又名金属组氨酸甲基内盐，是分子量较小，富含半胱氨酸的非酶蛋白质，其内含有镉、铜、锌、汞等金属元素，不含芳香组胺酸残基。MT与微量元素代谢、重金属解毒、自由基清除以及应急反应有关。是一种广泛存在于各种组织的蛋白质。这些蛋白具有很高的结构稳定性。分析不同的动物和不同的组织器官，发现MT氨基酸组成差异很小。在真菌和动物体内，MT能够缓解镉、汞等有害元素的毒害并在不同应激条件保护机体，被认为是和生物体解毒有关的蛋白，在脊椎动物，MT则被更多地认为和锌的储藏和代谢有关。最显著的功能是可消除体内过量的自由基、重金属及有害物质的污染。在如今环境污染日趋严重的情况下，这种能增强自 身抗污染能力的产品，将越来越为人们所需要。香菇多糖、糖蛋白及 其衍生物具有较强的保肝、抗衰老、增食欲等功效，它是一种有效的免疫激活剂和调节剂，能通过提高机体免疫功能，抑制癌细胞的生长 和扩大。

　　聚丙烯酰胺是以丙烯酰胺和甲撑双丙烯酰胺聚合而成的具有三维网状结构的凝胶，其孔径可调，性质稳定，无色透明。用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳的支持物分离蛋白，具有分辨力高、酶活性影响小、显带效果好等优点，因此应用广泛。

　　近年来，河流湖泊及近海海域不同程度受到重金属的污染，镉被美国毒理委员会列为第6位危及人体健康的有害物质。镉(Cd)是人体非必需元素，在自然界中常以化合物状态存在，一般含量很低，在正常环境下，不会影响人体健康。镉被人体吸收后在体内形成了镉硫蛋白，选择性地储存于肾、肝中，其中肾脏可吸收进入人体近1/3的镉，是镉 中毒的“靶器官”。其它如脾、胰、甲状腺和毛发等也有一定量的积蓄。镉在体内可与含羟基、氨基、硫基的蛋白质分子结合，使许多酶系统受到抑制，从而影响到肝、肾器官中酶系统的正常功能。由于镉损伤肾小管，病者出现糖尿、蛋白尿和氨基酸尿，特别是使骨骼的代谢受阻，造成骨质酥松，萎缩，变形等症状。

　　本实验通过体外暴露氯化镉染毒法处理长江华溪蟹，对华溪蟹的蛋白进行SDS-PAGE电泳，得到相应的分子量，并通过紫外分光光度计对华溪蟹体内的金属硫蛋白进行鉴定。

        一、实验材料和仪器

        1.材料：华溪蟹于家门口的水场市场购回，先在实验室的饲养池中用清水驯养数天，不喂任何食物，选取大小均等、重量相似的个体进行染毒处理。

        2.部分主要仪器：高速冷冻离心机Centrifuge 5804R(eppendorf)，高速台式离心机 Centrifuge 5415D(eppendorf)，恒温水浴锅，循环水式多用真空泵，超低温冰箱MDF-U50V(日本SANYO)，国产凝胶柱(上海华美实验仪器厂,26*100)，SephadexG-50(Amerchsham)，AKTA Prime蛋白纯化系统(Amersham)，UV-2102 PC型紫外可见分光光度计(UNICOTM)

      二、 实验过程：

　　1.体外镉暴露法染毒

　　因为镉对金属硫蛋白有高度的诱导作用，所以在的、高镉环境中可以诱导华溪蟹的金属硫蛋白的产生。[14]

　　通过查阅资料及进行预实验，最终确定染毒的镉溶液浓度为58mg/l染毒时间为30h提取组织为肝胰腺。实验华溪蟹的解剖，用镊子将华溪蟹从染毒缸中取出，用清水冲洗干净，在解剖盘中先将其附肢剪掉，然后打开蟹壳，腮为半片状，分布在两侧，可以很轻易的取出，卵巢分布在中后部，颜色为亮黄色，颗粒状，用镊子可以方便取出，肝胰腺在卵巢和心脏的下面，将心脏剥离后向下夹入便可夹出整个肝胰腺，其呈暗黄色，絮状，从华溪蟹的螯中取出肌肉，先将其剪开，再用手术刀从螯壁上刮下肌肉组织，其半透明粘性大。

　　2. MT粗提取的制备

　　取染毒华溪蟹的肝胰腺，按每克湿组织用3ml0.02mol/lTris-Hcl缓冲液(pH8.6)在玻璃研钵中充分匀浆，将匀浆液放入-800C的冰箱中保存备用。

　　3. Sephadex G-50凝胶柱的制备

　　（1）凝胶柱的清洗

　　将购买国产凝胶柱(26*100)用70%浓盐酸浸泡过夜，用洗衣粉水浸泡，冲洗，最后用去离子水冲洗干净。

　　（2）凝胶填料的溶胀

　　商品凝胶是干燥的颗粒状固体,将凝胶均匀铺洒在干净并且干燥的烧杯内,缓缓家入超纯水,使其溶胀.待凝胶体积超过烧杯容积1/2后,将一般凝胶转移至另一干净烧杯,防止凝胶溢出.用封口膜封住烧杯放2d,然后将烧杯放入真空泵抽滤2d,排除凝胶中的气泡.

　　(注意在凝胶溶胀和处理凝胶悬浮液的整个过程中,不能进行激烈的搅拌,这样会使凝胶颗粒破碎而产生碎片,以至影响层析的流速,在处理凝胶时,严禁使用电磁搅拌,它会象磨一样,在很短时间内把凝胶碾碎.)

　　（3）凝胶柱的装填

　　把凝胶柱竖直固定好(有滤膜的一端为底部),用Ph8.6Tris-Hcl缓冲液润洗后加入柱体积1/3Tris-Hcl缓冲液,将少量凝胶转移至小烧杯中家Tris-Hcl缓冲液,用玻璃棒轻轻搅拌均匀,并观察凝胶是否有不均匀处(若有不均匀处,可将不均匀凝胶重新搅拌使重新沉降),然后用玻璃帮引流到凝胶柱内并不停地轻轻搅拌使凝胶均匀沉降,直至凝胶沉降至柱顶约10cm处,加Tris-Hcl缓冲液至柱顶,盖好柱顶螺帽,并将凝胶柱与蛋白纯化系统连接好,用Tris-Hcl缓冲液反复洗脱.

　　（4）Sephadex G50 凝胶层析分离纯化MT

　　将装着已提取的染毒华溪蟹组织的EP管从冰箱中取出解冻,把组织倒入研钵加入1.5mlTris-Hcl缓冲液,充分研磨,将样品转至5mlEP管中,把EP管插在漂浮板上,放入80℃恒温水浴锅5min,取出后抽去表层脂肪,上样.

　　（5）洗脱峰紫外光谱扫描分析

　　（6）洗脱峰SDS-PAGE分析

　　三、实验结果与分析

　　1.SephdexG50凝胶层析分离纯化MT


　　图1为匀浆热沉淀处理上样经SephadexG-50凝胶柱层析图,洗脱液为0.01mol/L Tris-Hcl缓冲液,pH为8.60,洗脱速度为0.5ml/min,在254nm处检测吸光度,结果显示,层析后样品分为Ⅰ,Ⅱ两个峰.

　　2. 洗脱峰紫外光谱扫描分析

　　由于金属硫蛋白中不含有芳香族氨基酸,所以在紫外不能形成280nm特征光谱.但是由于金属硫蛋白在二级结构中形成特征性的巯基金属簇,而导致在紫外光谱中出现对应于金属簇结构的特殊吸收峰,吸收峰的位置主要决定于金属的种类,如:镉硫金属簇的吸收位于250nm附近,而锌硫金属簇的吸收峰位于225nm附近. 将接收峰Ⅰ,Ⅱ分别在190nm-300nm扫描。



　　图2，3分别为匀浆热沉淀处理上样洗脱峰Ⅰ,Ⅱ稀释8倍后在190nm-300nm间紫外吸收光谱.结果显示,洗脱峰Ⅰ在280nm处都有一个高的吸收峰,而洗脱峰Ⅱ在250nm附近具有一个高的吸收峰,在280nm处急剧下降,据此分析MT主要存在于峰Ⅱ中.

　　3.洗脱峰SDS-PAGE分析



　　图4，5为匀浆上样后洗脱峰SDS-PAGE电泳图谱,如图8所示峰2峰3蛋白浓度过低,经冷冻干燥浓缩再次上样,图9显示MT存在于峰Ⅱ中但未能得到完全纯化,还需进一步上离子交换柱层析分离.