主题:【讨论】您理解/明白正从事的分析方法为什么要那样做吗?

浏览0 回复20 电梯直达
Eda
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众所周知,一个合理的分析方法是结合了物化理论和分析要求而建立起来的科学方案。准确而全面地理解分析方法有助于分析人员建立其他新方法,并且有助于分析者解决分析中遇到的故障/问题。作为分析工作者,我们不仅要知其然,还应知其所以然。
本人发起这个话题是为了与广大网友展开交流,互相提高。

讨论格式如下:
分析方法案例:

水果和蔬菜中多菌灵和噻菌灵的检测

1 样品准备/提取
称取5 g均质样品,加入5 mL水,用0.1 mol/L NaOH溶液将样品的pH值调为10~11
之间;加入20 mL乙酸乙酯,振荡提取1 min6000 rpm下离心5 min,收集乙酸乙酯层,再用20 mL乙酸乙酯重复提取一次,合并有机相;将提取液30 ℃下减压蒸馏至近干,用6 mL 0.1 mol/L HCl分两次溶解残渣,待净化

理论依据:
多菌灵和噻菌灵均为含有疏水基团和胺基的化合物,在水果和蔬菜中,由于周围充满了pH略低于7的水溶液,两种化合物带质子,呈阳离子态,乙酸乙酯难以将其提取出来;将pH调为10-11,化合物解离出质子,呈中性,乙酸乙酯对其有较强溶解度。
乙酸乙酯提取后,需要用SPE净化,鉴于两种化合物的离子特性,我们选择了混合型阳离子交换反相柱(PXC),为了让化合物在PXC上较好保留,必须将乙酸乙酯转换成合适的溶剂,酸性的水溶液能是多菌灵和噻菌灵带正电荷,以便在PXC上保留,所以上样前,以0.1 mol/L HCl水溶液做上样溶剂。


2 SPE柱净化
ProElut PXC(混合型阳离子交换反相柱
60 mg/3 mL)
(1)    
化:3 mL甲醇活化,3 mL水平衡
(2)     样:将待净化液加入小柱,流出液弃去
(3)    
洗:依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗小柱,流出液弃去
(4)     脱:3 mL ,收集洗脱液
(5) 重新溶解:30下将洗脱液减压蒸馏至近干,1 mL流动相溶解,微孔滤膜过滤后供HPLC分析

理论依据:

活化/平衡:甲醇活化PXC,可使吸附剂浸润,作用位点处于活性态,并除去小柱中的杂质;水除去甲醇,以便与上样溶液具有相同的介质环境,以免活化用的甲醇干扰化合物保留;
上样:溶解有多菌灵、噻菌灵的样品溶液加入小柱,化合物中的胺基由于处于HCl水溶液中,结合质子,呈阳离子态,这些阳离子能够被PXC中的作用位点(磺酸基,阴离子)结合,而且化合物中的疏水基团还能与PXC中的苯乙烯基发生作用,因而被保留,其余多数杂质流出小柱;
淋洗:水可以除去水溶性杂质,甲醇洗去疏水性杂质
洗脱:5%
氨水甲醇溶液,氨水溶液呈碱性,使保留在柱中的化合物由阳离子态变为中性,打断化合物赖以保留的库伦力;甲醇打断化合物中的疏水基团与苯乙烯基的疏水作用。因而化合物被洗脱下来。
经SPE操作对化合物的选择性保留以及选择性洗脱,多菌灵和噻菌灵得到净化。



3
分析条件
色谱柱:Diamonsil C18(2)250×4.6 mm5 μm
流动相:磷酸缓冲液:乙腈=7525;磷酸缓冲液:0.01 mol/L磷酸二氢钠+0.01 mol/L磷酸氢二钠水溶液
流速:1.0 mL/min
检测器:
UV 288 nm
柱温:30

进样体积:
20 μL

理论依据:

多菌灵、噻菌灵为含有疏水基团和胺基的化合物,并且分子量处于2000以下,因而选择孔径为60-100 埃的C18柱即可,规格选择比较通用的250×4.6 mm,5 μm
由于多菌灵、噻菌灵带有胺基,具有潜在的解离性(pKb约为9),为了使化合物保持单一形态,流动相应大于12或小于7,pH=12对C18柱损害较大,因而被排除,最终选择了磷酸一氢盐+磷酸二氢盐(1:1,摩尔浓度)混合溶液,此溶液pH为7.2,符合多菌灵、噻菌灵分析;加入适量乙腈或甲醇使化合物能在合理的时间被洗脱出来;
对于内径4.6 mm的色谱柱,1 ml/min的体积流速能获得较高柱效;
检测波长由紫外-可见扫描得到,兼顾了两种化合物的特性。

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wuhy1984
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理论解决本质问题,经验解决实践问题。理论依据是必须的,增加自己的实践经验也是必不可少的。
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磷酸缓冲液:乙腈=75:25

乙腈的添加量是不是太多了啊

一般在2%——5%之间啊,它的添加只是峰型更加完美一些 \(^o^)/~
Eda
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原文由 gl19860312(gl19860312) 发表:
磷酸缓冲液:乙腈=75:25

乙腈的添加量是不是太多了啊

一般在2%——5%之间啊,它的添加只是峰型更加完美一些 \(^o^)/~

在反相色谱中,乙腈和甲醇等有机溶剂是为了提高流动相的洗脱能力,根据化合物极性强弱,有机相的比例会变动,以便使化合物具合适的保留因子。而非您所说的改善峰形。
生于八零年代
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xue2009
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应该是PKA值为9吧,那么其PH值调到小于7或大于12即可。个人认为你在这里阐述的不清楚,你问什么要把PH值调到7.2?难道仅仅是因为调到12对柱子不好吗?显然不是,你应该这样阐述(先给出你目标物的结构式):说明目标物的疏水性较强,即使结合质子以离子形式存在在C18柱上仍然有较好的保留,所以PH值调到7.2,试想如果你是目标物以离子形式存在,而在柱子上没有较好的保留,何谈分离?
  仅仅是个人的愚见,望大家指正
littleaimar
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碱性物质在小于其pka值两个PH值的情况下应该是带正电荷的,这样一来它与流动相中水相所形成的氢键作用力远大于它和C18链之间的作用力,也就是说保留很弱,要想改善这种情况应该添加对离子试剂。不知道大家觉着怎样
PS:个人使用过程中感觉迪马钻石二代比一代差很多,不知道是个别现象还是怎么回事
xue2009
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原文由 littleaimar(littleaimar) 发表:
碱性物质在小于其pka值两个PH值的情况下应该是带正电荷的,这样一来它与流动相中水相所形成的氢键作用力远大于它和C18链之间的作用力,也就是说保留很弱,要想改善这种情况应该添加对离子试剂。不知道大家觉着怎样
PS:个人使用过程中感觉迪马钻石二代比一代差很多,不知道是个别现象还是怎么回事

这种说法不无道理,但也考虑样品本身的疏水性。
小丑
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原文由 xue2009(xue2009) 发表:
应该是PKA值为9吧,那么其PH值调到小于7或大于12即可。个人认为你在这里阐述的不清楚,你问什么要把PH值调到7.2?难道仅仅是因为调到12对柱子不好吗?显然不是,你应该这样阐述(先给出你目标物的结构式):说明目标物的疏水性较强,即使结合质子以离子形式存在在C18柱上仍然有较好的保留,所以PH值调到7.2,试想如果你是目标物以离子形式存在,而在柱子上没有较好的保留,何谈分离?
  仅仅是个人的愚见,望大家指正

楼主说的多菌灵、噻菌灵均为碱性化合物,碱性化合物的电离常数的确应为Kb。酸碱化合物的解离常数,右下角的a代表酸(acid),左下角的b代表碱(base)。这里给出pKb是很准确的。有的文献也说碱性化合物的pKa,实际上说的是该化合物共轭酸的pKa。
另外,在反相色谱上,化合物以分子形式保留更好,但以离子态也未必不保留。楼主的这项分析,pH接近中性,多菌灵和噻菌灵应该是离子态的,但呈离子态也是能够在C18上保留的,只要具有足够的疏水基团。我觉得“xue2009”把化合物想象的太单纯,您可能觉得是离子态的化合物就不保留。
多看一下大学分析化学,您的基本知识会提高很多(我说话较直,不是想得罪谁,我是觉得论坛里尽量说一些正确的知识,免得误导别人)。见谅。
小丑
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原文由 小丑(joker) 发表:
原文由 xue2009(xue2009) 发表:
应该是PKA值为9吧,那么其PH值调到小于7或大于12即可。个人认为你在这里阐述的不清楚,你问什么要把PH值调到7.2?难道仅仅是因为调到12对柱子不好吗?显然不是,你应该这样阐述(先给出你目标物的结构式):说明目标物的疏水性较强,即使结合质子以离子形式存在在C18柱上仍然有较好的保留,所以PH值调到7.2,试想如果你是目标物以离子形式存在,而在柱子上没有较好的保留,何谈分离?
  仅仅是个人的愚见,望大家指正

楼主说的多菌灵、噻菌灵均为碱性化合物,碱性化合物的电离常数的确应为Kb。酸碱化合物的解离常数,右下角的a代表酸(acid),左下角的b代表碱(base)。这里给出pKb是很准确的。有的文献也说碱性化合物的pKa,实际上说的是该化合物共轭酸的pKa。
另外,在反相色谱上,化合物以分子形式保留更好,但以离子态也未必不保留。楼主的这项分析,pH接近中性,多菌灵和噻菌灵应该是离子态的,但呈离子态也是能够在C18上保留的,只要具有足够的疏水基团。我觉得“xue2009”把化合物想象的太单纯,您可能觉得是离子态的化合物就不保留。
多看一下大学分析化学,您的基本知识会提高很多(我说话较直,不是想得罪谁,我是觉得论坛里尽量说一些正确的知识,免得误导别人)。见谅。

还有拼写要正确,比如pKa,p指的是对数值取对数,然后前面加负号,次字母应为小写,和pH中的p一样;K为大写,斜体;a应为下标,在这里可能无法显示。
xue2009
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原文由 小丑(joker) 发表:
原文由 xue2009(xue2009) 发表:
应该是PKA值为9吧,那么其PH值调到小于7或大于12即可。个人认为你在这里阐述的不清楚,你问什么要把PH值调到7.2?难道仅仅是因为调到12对柱子不好吗?显然不是,你应该这样阐述(先给出你目标物的结构式):说明目标物的疏水性较强,即使结合质子以离子形式存在在C18柱上仍然有较好的保留,所以PH值调到7.2,试想如果你是目标物以离子形式存在,而在柱子上没有较好的保留,何谈分离?
  仅仅是个人的愚见,望大家指正

楼主说的多菌灵、噻菌灵均为碱性化合物,碱性化合物的电离常数的确应为Kb。酸碱化合物的解离常数,右下角的a代表酸(acid),左下角的b代表碱(base)。这里给出pKb是很准确的。有的文献也说碱性化合物的pKa,实际上说的是该化合物共轭酸的pKa。
另外,在反相色谱上,化合物以分子形式保留更好,但以离子态也未必不保留。楼主的这项分析,pH接近中性,多菌灵和噻菌灵应该是离子态的,但呈离子态也是能够在C18上保留的,只要具有足够的疏水基团。我觉得“xue2009”把化合物想象的太单纯,您可能觉得是离子态的化合物就不保留。
多看一下大学分析化学,您的基本知识会提高很多(我说话较直,不是想得罪谁,我是觉得论坛里尽量说一些正确的知识,免得误导别人)。见谅。

请你仔细看我回复的措辞,我有说过离子态的化合物不保留吗?你仔细看看我的贴就知道我考虑全不全面了,这里如果它的PKb为9的话,那么其PKa值不就是为5了吗?建议你要仔细看看别人的帖,因为在这上面回帖的人大多数是仔细考虑的,谢谢。
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