主题：【原创】【第三届原创大赛】植物官石蜡切片及显微摄影学习经历

　　植物的一切生命活动，都是以细胞作为基本结构和功能单位进行的。因此，对植物的组织、器官的研究就显得非常重要。石蜡切片法是动物、植物和病理组织切片制作上最重要、最常用的一种方法。由此方法制作的切片在显微镜下观察清晰，能显示其细致结构，反映其真实性，而且可以长期保存。除某些材料确实经不住石蜡法中各种药剂的处理或加温而不能应用外，一般的材料都可以采用石蜡切片法来制成装片在显微镜下观看或长期保存。本法的优点是可以极薄的切片，并可制作大批或是连续的切片。而且以石蜡包埋的组织块还可以长期保存。番红-固绿染色法可以区分开结构中的木质化和纤维化部分。

　　显微摄影是一项重要的显微技术，在生物科学的研究中，从再现显微镜中物体影像的各种方法中比较，显微摄影是最好的方法。基建的结果除文字的描述外，显微照相能客观而生动的记录下生物体的细微结构或形态，它常与生物绘图技术配合，起到相辅相成的作用。本实验采用盆中冲洗的方法。整个冲洗过程需在暗室中进行。若为涂塑像纸则直接晾干，普通像纸要进行上光。

　　1 材料

　　1.1 材料

　　某植株(完整植株，长有新鲜叶片)、乐凯全色黑白胶卷(ASA100)、涂塑相纸、普通像纸

　　1.2 试剂

　　1.2.1 浓度为35%、70%、85%、95%、100%的酒精

　　1.2.2 二甲苯、二甲苯酒精等量混合液

　　1.2.3 包埋剂：纯石蜡配制

　　1.2.4 染色剂：浓度为2% 番红水溶液(用水配制)、0.1% 固绿(由95%酒精配制而成)

　　1.2.5 固定液FAA(福尔马林 、冰醋酸、70%酒精以1:1:6比例配制)

　　1.2.6 封固剂：加拿大树胶

　　1.2.7 D-72显影液： 50℃温水 750ml，米吐尔 3.1g，无水亚硫酸钠 45g，无水碳酸钠67.5g，对苯二酚 12g，溴化钾 1.9g，然后加冷水至1000ml。

　　1.2.8 定影液F-1和F-5。

　　F-5定影液：50℃温水600ml，结晶硫代硫酸钠240g，无水亚硫酸钠15g，28% 乙酸 48ml，硼酸 7.5g硫酸铝钾 15g，然后加冷水至1000ml。

　　1.2.9 停影液: 水

　　1.3 工具及仪器

　　双面刀片、载玻片、盖玻片、培养皿、染色缸、镊子、旋转切片机、金属温台、毛笔、OlympusBH2型显微照相系统、放大仪、印相仪、上光仪等。

　　2 石蜡装片的制作

　　2.1 取材

　　从植株上取新鲜、健康、有代表性的叶片，用锋利的刀片切取幼茎、叶柄、叶片，并用水清洗干净。将幼茎与叶柄切成约5毫米长的小段，将叶片从主脉处切取5mm× 8mm的长方形，并保证切主脉两侧的叶片相等且主脉与短边平行，底部能立于包埋盒内。

　　2.2 固定

　　将已经配制好的FAA固定液倒入一个小试剂瓶中，再把已经切好的材料浸入其中，在瓶上贴好标签，待用。

　　2.3 浸洗

　　用50%酒精或70% 酒精浸洗一、二次就可以进行脱水。

　　2.4 脱水

　　包埋前的第一个重要步骤为脱水。本实验以酒精为脱水剂，采用逐渐提高酒精浓度来减少材料中水分的含量。可以以此梯度进行操作，70% 酒精、85%酒精 、95%酒精、无水酒精I、无水酒精II，在每级酒精中浸2～24小时，使脱水充分。

　　2.5 透明

　　酒精不能作为石蜡的溶剂，因此必须经过透明剂透明。二甲苯可以溶解石蜡，有利石蜡透入，同时还有脱去酒精的功效。但二甲苯易使组织收缩变脆，故浸留时间不宜过长。同时若脱水不干净，就会引起不良后果。为了避免组织收缩，在纯酒精或丙酮脱水以后，并不直接移入二甲笨中，其间必须经过几个梯度，逐渐置换，在每一级中停留的时间为1—2小时，二甲苯易挥发，在切片透明之后，从染色缸中取出封藏，手段要敏捷，不宜久置。在纯酒精中脱水后需要经过的几种溶液配比如下：



　　2.6 浸蜡

　　石蜡能溶于透明剂二甲苯中。把已透明的材料投入熔化的石蜡中，即可取代透明剂，而使组织中的一切空隙为石蜡透入而填满，即为浸蜡。为了使石蜡更好地浸透到组织中去，浸蜡一般需要经过四个不同配比的溶液，在前三杯溶液中停留半小时左右，在温箱中或在包埋箱中进行。然后取出在经第四种溶液。保温箱的温度要适宜，太高，会使材料收缩，太低，石蜡会冻结而不能透入组织。



　　2.7 包埋

　　包埋是将浸过蜡的组织块包埋于石蜡中以利于切片。将已熔化的石蜡倒入做好的包埋盒内，然后用酒精灯加热的镊子将材料从石蜡液中取出，迅速放入纸盒里的石蜡中。放置的方向要按照切片的方向而定，最好把切面向下，并且放正。若石蜡中有气泡，也可用热针刺入石蜡中，将气泡烫去。材料块放置妥当后，以左右手分持纸盒两耳，半浸于冷水中，并用口吹气使蜡表面凝结，蜡凝后，除去纸盒即成蜡块。

　　包埋过程中应注意的事，包埋蜡的温度不宜过高，否则会将组织烫坏。

　　2.8 切片

　　首先要修块，将已凝固的蜡块取出，用刀片把它切至何时大小，修整平滑。然后将蜡块底部稍融化贴在一小木块上，再用融化的蜡粘在蜡块的四周使蜡块牢固帖在木块上。将带石蜡的木块装在旋转式切片机上，将切片刀装在夹刀部位上，调整切片刀的角度，进行切片。将切下的条状蜡带，用毛笔取下放于一张纸上，挑取较好的一小条蜡带做切片。

　　2.9 粘片和展片

　　以手指涂一薄层Mayer甘油蛋白于干净载玻片上，再用滴管滴一滴蒸馏水于载玻片上，然后用镊子挑取一段切片蜡带置于载玻片的水面上(注意：要以石蜡切片背面比较光滑的一面放在水上，才易展平)。然后将载玻片放在金属温台上加热，使切片蜡带自由展平。注意，载玻片上的水要多放一点，加热温度不要过高，否则石蜡会熔化，组织脱落。自然风干。

　　2.10 番红-固绿染色

　　2.10.1 溶蜡

　　将切片放入二甲苯溶液中，5～10分钟，彻底除去切片上的石蜡。如果室温过低，需延长脱蜡的时间，脱蜡要彻底，否则染色困难。

　　2.10.3 复水

　　将切片经纯酒精和二甲苯的1:1的溶液，100%、95%、70%、35%酒精溶液各3分钟。逐步过渡，防止材料收缩。

　　2.10.4 蒸馏水浸洗

　　因为染色液番红是用蒸馏水配置的，应将切片放入蒸馏水中3分钟，以便彻底复水，然后进行染色。

　　2.10.5 初染

　　将切片放入2%的番红水溶液中染色10～20分钟，使红色染透，否则材料容易褪色。如果番红染色过度，应返回到酒精中进行轻微脱色，再进行以下操作。

　　2.10.6 流水冲洗

　　用流水冲去多余染液，以冲洗去切片上的番红余色。而且对一些不易被固绿着色的幼嫩组织材料，其切片经水冲洗后吸水膨胀，染色剂易于渗入组织进行染色。

　　2.10.7 镜检

　　将载玻片放在显微镜的载物台上，进行镜检，染色效果良好，则可进入下一步操作。

　　2.10.8 脱水

　　将切片依次经过35%，70%的酒精各30秒。因为固绿是用95%酒精配置的，因此应脱去水分再进行固绿染色。

　　2.10.9 复染

　　用0.1%固绿染色5～10秒，时间不宜过长，否则绿色太深，将切片变为蓝绿色或深绿色，失去的双重染色的意义。

　　2.10.10 镜检

　　将切片放入95%的酒精过一下后，进行镜检。所染材料的木质化部分呈红色，纤维素部分呈绿色。

　　2.10.11 浸洗

　　用100%的酒精溶液浸洗3分钟，以洗去切片上固绿的余色，同时也使切片过度到纯酒精中。该步时间不宜过长，由于固绿在纯酒精中易褪色。

　　2.10.12 透明

　　将切片放入纯酒精和二甲苯的1:1的混合溶液中浸3分钟，使切片从酒精中逐步过渡到纯的二甲苯溶液中。然后将切片放入纯的二甲苯溶液中，浸5分钟，使切片完全过渡到二甲苯溶液中。至材料完全透明后应立即进行封片(为防止二甲苯使组织收缩)。

　　对于脱水不彻底的材料投入到二甲苯溶液中时会出现乳白色雾状，这表明该材料无法进行透明，应该退回到无水酒精和95%的酒精进行重新脱水。

　　2.11 封片

　　把切片从二甲苯溶液中取出，用纸擦去载玻片上的多余液体。滴一滴加拿大树胶于组织上，用镊子夹取一片盖玻片，与载玻片成一倾斜的角度，使盖玻片的一个边缘与加拿大树胶完全接触，然后轻轻地覆盖下，防止产生气泡。树胶的量要适中，使盖玻片与载玻片之间没有空隙。

　　3 显微照相

　　3.1 安装好显微照相系统

　　将小型显微照相连接器连接到OlympusBH2型显微镜上。

　　3.2装胶片

　　打开相机后盖，装入35毫米胶片，盖好后盖。注意把胶片头部放入收片轴的片槽里时，不要使它超出片槽的另一端。

　　3.3 设置自动曝光器

　　根据胶片感光度(ASA)选择控制器上感光度标记，按下感光片类型标记按钮(35)。将胶片倒易律失效特性的修正数设置在中间档。

　　3.4 试拍

　　通过自动曝光控制器的曝光按钮按动2～3次，进行空卷空拍，在按动按钮时，要观察胶片记数器是否转动。若没有转动，则需要再打开照相机后盖，重新挂卷。

　　3.5 选拍摄区

　　将载玻片放到标本台上，选择需要拍摄的部位，将光栅调整到适当的程度。在对标本调焦之前，必须先调节调焦目镜上的调节圈，使使用者感到“+”字的双线清晰可辨。然后，从显微镜目镜中观察，将标本调节到最清晰状态。最后，从调焦目镜中观察，使用标本推进器将需拍摄部位调整到取景框范围内。

　　3.6 拍摄

　　按动自动曝光器上的曝光按钮，进行曝光拍摄。

　　4 照片的制作

　　4.1底片的冲洗

　　拍摄完后，在暗室中，将胶卷冲洗出来。

　　4.2 放大

　　将胶卷放在放大仪里，然后准备好的反差较大的3号印相纸，放在夹相纸的夹上，选好尺寸，固定好相纸。推开红色挡光台进行固定时间的曝光后，取出相纸。

　　4.3 照片的冲洗

　　感光片上的卤化银经显微摄影感光后形成潜影，再经化学药剂处理后，将潜影转变成肉眼可见的影象，即照片的冲洗。该过程要在全部暗室中操作。

　　4.3.1 显影

　　取大小适宜的显影盆，加入约1/3～1/2深度的显影液，像纸的药膜面朝上，迅速浸入D-72显影液中，用镊子轻轻翻动，使显影均匀，并在红光下观察，当显影到适当程度后，用竹夹将相纸转入停影液中。时间大约2～3分钟。

　　4.3.2 停影

　　将相纸在停影液中充分搅动，如果搅动不足还回导致出现相纸影像不均匀的现象。如果直接将相纸转入定影液中，则残留在相纸药膜中的显影液，仍会有短暂的显影作用，导致显影过度。然后将相纸转入定影液中。

　　4.3.3 定影

　　使相纸的药膜面朝下浸入定影液中，定影约15分钟。以便使相纸上未感光的卤化银溶解清除，使已经显影的影像固定下来，同时相片边缘清晰、透明度好。

　　4.3.4 上光

　　定影后，将相纸放入冷水中冲洗30分钟。若为涂塑相纸可直接晾干。若为普通相纸则要打开照明灯，对胶片进行上光。上好光后，相片即制作好了。

　　5 结果

　　5.1 石蜡装片制作的结果

　　装片制作完毕后，显微镜下的观察结果为木质化部分和表皮绒毛被染成红色，纤维素细胞壁、细胞质部分被染成绿色。但是由于染色时间把握不是非常恰当，可以看出固绿染色较好，但是番红染色时间不足，需要在以后的实验中进一步的探索与改进。

　　5.2 摄影的结果

　　结构清晰，反差明显，位置处于相纸中央。照片整体图像清晰、明快，效果较好。

　　6 讨论

　　6.1 关于石蜡装片制作

　　当我们转动旋转切片机转轮进行切片时，切片机机箱内的齿轮会带动固定石蜡的夹口往前推进。直到石蜡碰到切片刀刀口，满足我们需要厚度的切片也就形成了。 初切的片子往往不完整，这是由于蜡块的面不平所致，等切数片后，就能得到完整的蜡带。到蜡带长度达到 一定长度时，即可用毛笔挑起安放于的白纸上，按顺序排好，便于以后检查，操作时要敏捷准确。

　　粘片时先在载玻片上涂上一层加拿大树胶，要涂抹均匀，而且不能过多，否则粘片效果不好，在观察时也得不到清晰的图像。

　　在脱蜡时，应该在二甲苯中适度脱蜡完全。时间要适当，过短则脱蜡不完全影响染色;时间过长，组织收缩。

　　使用番红染色时，使红色染透，否则材料容易褪色。如果番红染色过度，应返回到酒精中进行轻微脱色，再进行以下操作。而且，用0.1%固绿染色5-10秒，时间不宜过长，否则绿色太深，将切片变为蓝绿色或深绿色，失去的双重染色的意义。

　　6.2 关于显微摄影

　　调焦要准确适当，曝光量要适中。不同的底片曝光时间有差异，故事先可做一个梯度曝光以确定适宜的曝光时间[6]。

　　冲洗胶片时，要在全暗的环境中操作。制作照片时，可在红色安全灯下操作。在显影过

　　程中，要根据不同的胶片设定不同的显影时间，应注意在红色安全灯下检查，而且红光下影象的颜色比日光灯下深，要及时观察防止显影过度。

　　在对相纸进行上光的过程中，要用滚轮经常在上光仪上滚动挤出水分，压平相纸。否则相片会皱折不展，影响效果。

　　7 收获

　　本实验从材料的获取到装片的制作，从显微镜下观察到显微照相，经历了这一系列的过程，从中学到了许多东西，除了有关的理论知识，实际操作能力得到了很大的提高。当然，在这中间也有失败的地方，但是从失败得到的体验是最深刻的。长时间持续的实验更要求我们科学严谨的态度，这对我们以后的学习和工作也是必不可少的。

这是之前学习切片和显微摄影的时候做的记录，看到有活动就发出来与大家共同分享讨论~~~最后拍得的照片找不到了~有点小遗憾，不过我会尽力再在自己的实验记录中找找的~~~找到后一定更新上来哦~~