主题：【分享】沙门氏菌及检验

16、田鸡腿（此方法用于国内的和国外的所有田鸡腿检验）：

　　将15对田鸡腿放入灭菌塑料袋内，并用灭菌乳糖肉汤浸没。如果单个腿估计平均重在25g或以上，则只需检查15对的每对中的一条腿。把袋放入大塑料烧杯内或其它合适的容器中，在机械荡器上震荡15min，以4cm（1-1/2in）机械振荡100次/分钟。从袋中倾倒出乳糖肉汤于另一个灭菌塑料袋内。加更多的乳糖肉汤，使总量为3500mL。充分混匀，于室温下静置60分钟。必要时调节pH值至6.8±0.2。再把装有乳糖肉汤的塑料袋放入塑料烧杯或其它合适的容器内，于35℃培养24±2小时。接下去按下面的四，1�10节进行。

17、野兔骨架（此方法用于国内的和国外的所有的野兔骨架）：

　　取3只野兔骨架放入灭菌塑料袋内，并用灭菌乳糖肉汤浸没（见上述A，23�25节），把袋放入大塑料烧杯内或其它合适的容器中，在机械震荡器上以4cm（1-1/2in）幅度振荡100次/分钟，震荡15min。从袋中倾倒出乳糖肉汤混合物于另一个灭菌塑料袋内，加更多的乳糖肉汤，使总量为3500mL。充分混匀，于室温静置60分钟。必要时用pH试纸调置6.8±0.2，于35℃培养24±2小时。接下去按下面的四，1�10节进行。

18、口香糖：

　　无菌操作称取25g样品到灭菌烧杯（250mL）或其他合适容器中。制备过滤除菌的1.0%纤维素酶溶液（加1g纤维素酶到99mL无菌水中），用0.45um膜过滤除菌，置于150mL瓶中。（纤维素酶溶液在2·-5℃可保存最长2周时间）。加入225mL无菌乳糖肉汤和2.25mL无菌1%纤维素酶溶液于500mL无菌带螺旋盖的广口瓶或其他合适容器。用磁力搅拌器剧烈搅拌酶/肉汤混合物时，通过无菌玻璃漏斗迅速倒入25g待检样品。旋好瓶盖，室温下静置60分钟，无须调pH值。旋松瓶盖，35℃培养24±2小时。以下按四进行。

四、沙门氏菌的分离

　　1、拧紧瓶盖并轻轻振荡培养过的样品混合物。

　　生鲜食物、严重污染的食品和动物饲料：

　　转移0.1mL混合物到10mLRAPPAPORT�VASSILIADIS（RV）肉汤培养基中，另转移1mL混合物到10mL四硫磺酸盐肉汤（TT）中。

　　其它食品：

　　转移1mL混合物到10mL亚硒酸盐胱氨酸肉汤（SC）中，另转移1mL混合物到10mL四硫磺酸盐肉汤（TT）中。

　　2、选择性增菌按如下步骤进行：

　　生鲜食品、严重污染的食品和动物饲料：

　　RV培养基在42±0.2℃（水溶）中培养24±2小时。TT肉汤在43±0.2℃（水溶）中培养24±2小时。

　　其它食品：

　　SC和TT肉汤在35℃培养24±2小时。

　　3、混合均匀（如果是试管，涡旋式混合），用3mm直径的接种环，满环（10μl）划线接种TT肉汤于亚硫酸铋（BS）琼脂，木糖赖氨酸去氧胆酸盐（XLD）琼脂和HEKTOEN氏肠道菌（HE）琼脂平板上。BS琼脂平板于划线接种的前一天制备好储存在室温暗处。

　　4、再用3mm直径的接种环， 从RV培养基（样品为生鲜食物，严重污染的食品和动物饲料）和SC肉汤（除了生鲜食物，严重污染的食品和动物饲料以外其它样品）取满环（10μl），划线接种于上述平板上。

　　5、把选择性平板置35℃培养24±2小时。

　　6、检查平板中可疑沙门氏菌菌落的存在。

　　典型的沙门氏菌菌落形态：

从每个经过24±2小时培养后选择性平板上挑 取2个或更多个菌落。典型的沙门氏菌菌落如下：

　　A、在HEKTOEN氏肠道菌（HE）琼脂上。

　　菌落呈兰绿至兰色，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可呈现大的光泽黑色中心或几乎全部黑色的菌落。

　　B、在木糖赖氨酸去氧胆酸盐（XLD）琼脂上。

　　粉色菌落，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可有大的光泽黑色中心或呈几乎全部黑色的菌落。

　　C、亚硫酸铋（BS）琼脂上。

　　呈褐色，灰色或黑色，有时带有金属光泽。菌落周围的培养基通常开始呈褐色，但伴随培养时间的延长而变为黑色，并有所谓的晕环效应。

　　如果典型菌落出现在经24±2小时培养后的BS琼脂上，则挑取2个或更多个典型菌落。不论BS琼脂平板在培养24±2小时时是否挑取过菌落，BS平板再培养24±2小时。培养了48±2小时后，如果BS平板上出现典型菌，则挑取2个或更多个菌落，如果只在经过24±2小时培养的BS平板上挑取了菌落，接种到三糖铁琼脂（TSI）和赖氨酸琼脂（LIA）上，会呈现非典型反应以至视为培养物中不存在沙门氏菌 。参见下面四.8部分和四.9部分，有关TSI和LIA反应的详细描述。

非典型的沙门氏菌菌落形态：

　　不存在典型的或可疑的沙门氏菌菌落时，按如下步骤检验非典型的沙门氏菌菌落。

　　A、HE和XLD琼脂：

　　非典型的沙门氏菌在HE和XLD琼脂上呈黄色菌落，带或不带黑色中心。HE和XLD平板经24±2小时培养后，没有典型的沙门氏菌菌落，则挑取2个或更多个非典型的沙门氏菌菌落。

　　B、BS琼脂：

　　某些非典型菌株产生绿色菌落，其周围培养基稍微或不呈暗色。如果BS平板培养24±2小时后，没有出现典型菌落，则不挑取任何菌落，让平板继续培养24±2小时。如果经48±2小时培养后，仍没有典型或可疑的菌落出现，则挑取2个或更多个非典型的菌落。

　　7、用灭菌接种针轻轻地接触每个菌落中心部位，接种TSI斜面，先在斜面上划线，再于底层穿刺。不需灼烧接种针，即可接种LIA斜面，先穿刺接种底层两次，再划线斜面上。由于赖氨酸脱羧反应需严格厌氧条件，因而LIA斜面必须有深的底层（4cm）。将已挑过菌落的选择性平板于5�8℃储存。

　　8、将TSI和LIA琼脂斜面于35℃分别培养24±2小时。当进行斜面培养时放松试管帽以保持需氧条件，以防止过量的H2S产生。

　　在TSI琼脂中，典型的沙门氏菌培养物使斜面呈碱性（红色），底层呈酸性（黄色），产生或不产生H2S（琼脂变黑色）。在LIA琼脂中，典型的沙门氏菌培养物其试管底层呈碱性（紫色）反应。只有试管底层呈明显黄色时才认为有酸性（阴性）反应。不要单纯根据其试管底层产生的褪色反应就排除它。在LIA中，大多数沙门氏菌培养物皆产生H2S；一些非沙门氏菌培养物产生砖红色反应。

9、在LIA琼脂上所有底层呈碱性反应的培养物，无论其在TSI琼脂上反应如何，皆应全部保留为可疑的沙门氏菌分离物，并进一步做生化和血清学试验。在LIA中呈酸性底层反应和在TSI中呈斜面碱性，底层酸性的培养物，均视为可疑的沙门氏菌分离物，应进一步做生化和血清学试验。在LIA中呈酸性底层和在TSI中呈酸性斜面和酸性底层的培养物，可视为非沙门氏菌培养物而弃去。对所保留的拟定阳性TIS琼脂培养物，可按下面四，10节叙述的进行检测，是否为沙门氏菌，包括亚利桑那沙门氏菌。如果TSI中培养物没有呈现沙门氏菌的典型反应（斜面碱性，底层酸性），再从未拟定阳性的选择性平板上另外挑取可疑菌落，象上面四，7节所述的接种TSI和LIA斜面。

　　10、生化和血清学鉴定试验：

　　a从亚硒酸盐胱氨酸肉汤（或相应食品的RV培养基）划线分离的选择性琼脂平板上所挑取的3个拟定阳性TSI琼脂培养物和从四硫磺酸盐肉汤划线分离的选择性平板所挑取的3个拟定阳性TSI琼脂培养物，进行生化和血清学鉴定试验。

　　b如从一组选择性琼脂平板未分离出3个拟定阳性的TSI琼脂培养物，则对其它已分离到的拟定阳性的TSI琼脂培养物进行生化和血清学鉴定试验。对所分析的每个25g样品，至少应检查6个TSI培养物。

五、沙门氏菌的鉴定：

　　1、混杂培养物：

　　对呈混杂菌的TSI琼脂培养物，皆应划线接种于麦康凯（MC）琼脂，HE琼脂，或木糖赖氨酸去氧胆酸盐（XLD）琼脂上，于35℃培养24±2小时。检查平板上可疑沙门氏菌存在与否。

　　a、在麦康凯（MC）琼脂上：

　　典型菌落呈透明、无色，有时带有暗色中心。沙门氏菌菌落有时可使培养基中其它细菌所造成的胆盐沉淀区透明。

　　b、在Hektoen氏肠道菌（HE）琼脂上：见上述四，6a。

　　c、在木糖赖氨酸去氧胆酸盐（XLD）琼脂上：见上述四，6b。

　　按上面的四，6节所述转种至少2个可疑沙门氏菌菌落到TSI琼脂和LIA琼脂斜面上，接下去按上述的四，8节进行鉴定。

　　2、纯培养物：

　　a、尿素酶试验（常规）。由每个拟定阳性TSI琼脂斜面培养物，用灭菌针分别接种生长物到每个尿素肉汤试管中。偶尔也会有未接种的尿素肉汤管变紫红色（试验阳性），因而应包括未接种该肉汤管作为对照，于35℃培养24±2小时。

　　b、可选的尿素酶试验（快速法）。用3mm直径接种环，自每一拟定阳性的TSI琼脂斜面培养物中取2环转种到快速尿素肉汤管中，37±0.5℃水浴中培养2小时。弃去所有呈阳性结果的培养物，保留所有阴性反应的（培养基不变色）培养物，为进一步研究试验用。

3、血清学多价鞭毛（H）试验：

　　a、此时或以后进行多价鞭毛（H）试验，可按下面五，4节所述进行。从每个尿素酶阴性的TSI琼脂斜面培养物接种到以下任一项， 1）脑心浸液肉汤，于35℃培养4�6小时，直到可见的生长物出现（供当日试验用），或2）胰胳胨大豆肉汤，于35℃培养24±2小时（供次日试验用）。在各5mL肉汤培养物中加2.5mL甲醛生理盐水溶液。

　　b、选两个以甲醛处理的肉汤培养物同沙门氏菌多价鞭毛（H）抗血清试验。在10×75mm或13×100mm血清学试管内，加入0.5mL经合适稀释的沙门氏菌多价鞭毛（H）抗血清，再加入0.5mL待测抗原进行试验。并以0.5mL甲醛生理盐水溶液同0.5mL甲醛处理的抗原混合好，制成盐水对照，将各混合物于48�50℃水浴培养，每隔15分钟观察一次初步结果，并于1小时读数最终结果。

　　阳性反应：在甲醛肉汤培养物与血清混合物中凝集，而在甲醛肉汤培养物与甲醛盐水管中（对照管）不凝集。

　　阴性反应：在甲醛肉汤培养物与血清混合物中（试验混合物）不凝集，在对照管中也不凝集。

　　非特异反应：在试验混合物与对照管中皆出现凝集。对出现这类结果的培养物，需用“Spicer　Edwars”氏抗血清做进一步试验。

　　4、尿素酶阴性培养物试验：

　　a、赖氨酸脱羧酶肉汤。如果所做的LIA试验是满意的，则不需重复试验。如果培养物呈现可疑的LIA反应，则以赖氨酸脱羧酶肉汤进行赖氨酸脱羧酶的最终鉴定。将少量可疑沙门氏菌阳性TSI琼脂斜面培养物接种至赖氨酸脱羧酶肉汤管。将试管帽旋紧，置于35℃培养48±2小时，至少每隔24小时检查一次。沙门氏菌因碱性反应，则使整个培养基呈紫色。阴性反应则使整个培养基呈黄色。如果培养基出现褪色现象（即不呈紫色也不呈黄色），可加入几滴0.2%溴甲酚紫溶液，然后再观察试管的反应。

　　b、酚红卫茅醇肉汤或含有0.5%卫茅醇的紫色肉汤基础液。由TSI琼脂上取少量培养物接种至肉汤管中。将试管帽放松。置于35℃培养48±2小时，但24h后观察反应。大多数沙门氏菌呈阳性实验结果，表现为内部发酵管中产气和培养基变酸（黄色）。产酸为阳性反应。阴性反应为倒管内无气体产生。整个培养基呈红色（有酚红指示剂）或紫色（有溴甲酚紫指示剂）。

c、胰蛋白胨（或色氨酸）肉汤。将少量TSI琼脂培养物接种到肉汤管中，置35℃培养24±2小时，并按以下进行试验。

　　1)氰化钾（KCN）肉汤。

　　从24h色氨酸培养物移取3mm接种环一环转种到KCN肉汤管中。将管口加热，以便加塞时蜡封良好。35℃培养48±2小时，但24h后观察反应。有生长者（有浑浊）为阳性。大多数沙门氏菌在此培养基中不能生长，即无浑浊现象。

　　2)丙二酸盐肉汤：

　　用3mm接种环移取24h色氨酸肉汤培养物，转种到丙二酸盐肉汤管中。因偶尔会出现未接种的丙二酸盐肉汤在存放期间变兰（阳性反应），所以应有未接种的丙二酸盐肉汤管作对照。35℃培养48±2小时，但在培养24h后观察反应。大多数沙门氏菌培养物在此肉汤中为阴性反应（绿色或不变色）。

　　3)吲哚试验：

　　转种5mL24h色氨酸肉汤培养物到空试管中，加入0.2-0.3mLKovacs氏试剂，大多数沙门氏菌培养物为阴性反应（在肉汤表面无深红色）。并记录呈桔色和粉色变化的中间型为±反应。

　　4)沙门氏菌血清学鞭毛（H）试验：

　　如果未做多价鞭毛（H）试验或Spicer-Edwards氏鞭毛（H）试验，可任选其一。

　　5)吲哚试验阳性和血清学鞭毛（H）试验阴性；或者KCN试验阳性和赖氨酸脱羧酶试验阴性的非沙门氏菌任一培养物予以去除。

5、沙门氏菌血清学菌体（O）试验。（用已知沙门氏菌培养物同所有抗血清做予试验）。

　　a、多价菌体（O）试验：

　　用蜡笔在每个玻璃或塑料平板（15×100mm）内侧划出2个约1×2cm的区域。可使用商品化的分区载玻片，用2mL0.85%生理盐水乳化从24-48hTSI斜面或者更好是胰胨血琼脂基础（无血），用3mm接种环移取培养物。加1滴菌悬液于用蜡笔标出的每一矩形区域的上部。这一区域的下部加1滴生理盐水。在另一区域加1滴沙门氏菌多价菌体（O）抗血清。再以干净灭菌的接种环或针将一个区域内的菌悬液和生理盐水混合。在另一区域内菌悬液和抗血清液混合。将混合液前后倾斜移动1min，并在良好照明下对着黑暗背景观察，任何程度的凝集都视为阳性反应。多价菌体（O）试验结果分类如下：

　　阳性反应：混合物试验凝集，而在盐水对照中不凝集。

　　阴性反应：混合物试验不凝集，在盐水对照中也不凝集。

　　非特异性反应：混合物试验和盐水对照中皆凝集，需按Edwards和Ewing氏的肠杆菌科鉴定中所描述的进一步作生化学和血清学试验。

　　b、菌体(O)群试验

　　如有各群菌体（O）抗血清，包括Vi，代替沙门氏菌多价菌体（O）抗血清，按上述五，5a试验。对Vi凝集反应阳性的可参照官方分析分析方法的967.28B部分专门处理这些培养物。与菌体（O）群抗血清呈阳性凝集的培养物，作该菌体（O）群阳性记录；不能与菌体（O）群抗血清发生反应者，做该菌体（O）群试验阴性记录。

6、补充生化试验

　　按表1中1-11项试验，对培养物呈典型沙门氏菌反应者，进行沙门氏菌分类。如在25g分析样品中有一个TSI培养物被划为沙门氏菌，则该25g分析样品的其他TSI培养物就无需进一步试验。沙门氏菌鞭毛（H）试验阳性表明有沙门氏菌抗原，但不具有沙门氏菌生化特性者，应对培养物作纯分离（按上述五、1），按上述五、2开始重新做试验。

　　对表1中1-11项目，不呈典型沙门氏菌反应的培养物做以下补充试验以最终判断为非沙门氏菌。

　　a、酚红乳糖肉汤或紫色乳糖肉汤。

　　1)从每个尚未分类的24-48hTSI琼脂斜面上挑取少许培养物，接种到肉汤管中，35℃培养48±2h。并在24h后开始观察变化。

　　阳性反应：产酸（黄色）和在倒立发酵管内产气。只要产酸就视为阳性反应。大多数沙门氏菌为阴性结果。即在倒立发酵管内没有气体形成，和整个培养基呈红色（含酚红指示剂）或紫色（含溴甲酚紫指示剂）。

　　2)除培养物在TSI琼脂斜面上产酸和在LIA中呈阳性反应，或丙二酸盐肉汤试验呈阳性的培养物外，弃去乳糖试验阳性的非沙门氏菌培养物。为了证明他们是否为亚利桑那菌，需对这些培养物作进一步试验。

　　b、酚红蔗糖肉汤或紫色蔗糖肉汤。

　　按上述五,6a-1所叙述的程序进行，除那些培养物在TSI琼脂斜面上产酸和在LIA中呈阳性反应者外，呈蔗糖试验阳性结果者皆作为非沙门氏菌弃去。