目的： 建立HPLC法测定川木通药材中齐墩果酸含量的方法。方法： 采用Hypersil BDS C₁₈色谱柱（4.6mm×200mm，5μm）。流动相：甲醇:水（81:19，内含0.5%醋酸，0.2%三乙胺），柱温35℃，流速1.0 mL/min，检测波长215nm。结果： 齐墩果酸在31.56μg·mL^-1～1010μg·mL^-1呈良好的线性关系（r = 0.9996），平均回收率为100.9%，RSD =1.6%，川木通药材中齐墩果酸的含量为77.33mg g^-1。结论： 本法灵敏，准确，重现性好，可作为川木通药材中齐墩果酸的含量测定方法。

关键词：川木通；齐墩果酸；HPLC

Extraction and Content Determination of Oleanolic acid in Caulis Clematidis Armandii

ABSTRACT

Objective:To develop an HPLC method for the content determination of oleanolic acid in Caulis Clematidis Armandii. Methods:A Hypersil BDS C₁₈ chromatographic column （4.6mm×200mm,5μm）was used; methanol -water(0.5%acetic acid,0.2%triethylamine)（81:19）was the mobile phase;the column temperature was at 35℃;the flow rate,1.0ml/min,UV detection wavelength,215nm. Results : There was a good linear in the range of 31.56μg·mL^-1～1010μg·mL^-1 for oleanolic acid (r = 0.9996).The average recovery of oleanolic acid was 100.9%,the RSD was 1.6%,the content of oleanolic acid in Caulis Clematidis Armandii was 77.33mg·g^-1 . Conclusion : This method is sensitive, accurate, reproducible and can be used as Caulis Clematidis Armandii oleanolic acid method for the determination.

Key words：Caulis Clematidis Armandii；Oleanolic acid；HPLC

川木通中齐墩果酸的提取和含量测定

前言

木通是常用中药，临床应用十分广泛。在“关木通”的肾毒性未引起重视之前，药品使用单位往往以“木通”为药斗名，关木通与川木通混用^[1]。近年来，关木通因含马兜铃酸、具有肾毒性而在国内外遭到禁用，川木通由于与关木通同为传统的木通类药材，在此风波中亦受到波及。所以，了解及研究川木通对于该资源的合理开发和有效利用具有重要的现实意义。

川木通为毛茛科铁线莲属植物小木通Clematisarmandii Franch. 或绣球藤Clematismontana Buch.-Ham. 的干燥藤茎，其味淡、微苦、寒,归心、肺、小肠、膀胱经，具有利尿通淋，通经下乳之功效，用于水肿、淋病、小便不通、关节痹痛、经闭乳少等症的治疗^[2]。据报道，其含有齐墩果酸皂苷^[3]、黄酮苷^[4]及木脂素^[5]等成分。关木通用药标准被取消^[6]后，川木通作为药材木通又在市场上逐渐恢复使用。因此,建立木通药材有效的质量评价方法，直接关系到木通相关药品和临床处方的疗效。本文旨在研究川木通中齐墩果酸（Oleanolic acid,OA）的提取和含量测定方法，为川木通质量标准提供科学依据。

材料与方法

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪，紫外检测器，HP HPLC（3D）化学工作站（美国安捷伦）。A/D电子分析天平（1/10万，日本）。超声波清洗器（JN-5200DT，宁波江南仪器厂）。紫外可见分光光度计(UV-2100,美国Labtech)。

1.2 试剂

齐墩果酸标准品（中国药品生物制品鉴定所提供，批号110709- 200505），川木通对照药材（中国药品生物制品鉴定所提供，批号121409-200401），川木通药材（分别购自北京，安国，张家口），关木通药材（购自吉林）。

甲醇为色谱纯，所用水为去离子水，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 实验部分

2.1.1 色谱条件

Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪，Hypersil BDS C₁₈（4.6mm×200 mm， 5μm）色谱柱，紫外检测器。流动相：甲醇-水（0.5%冰醋酸，0.2%三乙胺）。流速：1.0mL/min。柱温：35℃。进样量：20μL。检测波长215nm。

2.1.2 对照品溶液的制备

称取齐墩果酸对照品10. 1mg，甲醇溶解，定容至10.00mL，得1.01 mg·mL^-1的齐墩果酸对照品溶液，备用。

2.1.3 样品溶液的制备

川木通药材粉碎过40目药筛，取药材粉末5g，精密称定，置于250mL具塞锥型瓶中，加50 mL甲醇浸泡12h，超声提取35min，抽滤，残渣再同法提取两次，抽滤，合并滤液，酸水解3h，减压浓缩甲醇定容至5.00mL，进样前用0.45μm滤膜滤过，即得。

2.1.4 线性关系考察

精密吸取齐墩果酸对照品溶液，按1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128倍比稀释，加上原液，按2.1.1项下色谱条件依法进样，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，齐墩果酸的浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程。

2.1.5 含量测定

精密称定川木通药材，按2.1.3项下制备样品溶液，以2.1.1项下色谱条件测定，记录色谱图，用回归方程求出药材中齐墩果酸的含量。

2.1.6 比较试验

将川木通对照药材，四批川木通药材及关木通药材按样品溶液制备方法制备供试品溶液，分别进行紫外检测，比较紫外吸收图谱。

2.2方法学考察

2.2.1 色谱系统适用性

在2.1.1项下色谱条件检测齐墩果酸对照品及川木通药材，记录色谱图。

2.2.2 精密度实验

用齐墩果酸对照品溶液重复进样5次，每次进样量为20μL。记录色谱图，计算齐墩果酸的峰面积RSD值。

2.2.3 重复性实验

取购自四川的同一种川木通药材粉末3份，分别按2.1.3项下方法制备样品液并进样测定。记录色谱图，计算齐墩果酸的峰面积RSD值。

2.2.4 稳定性实验

取购自四川的川木通药材粉末，制备样品液，分别于提取后0、8、16、32、48h进样，记录并计算齐墩果酸的峰面积RSD值。

2.2.5 回收率实验

将样品溶液稀释2倍，取20μL注入高效液相色谱仪，测定并计算含量。取3份上述溶液，每份0.5mL，向其中分别加入0.050 mL， 0.075 mL ，0.10 mL齐墩果酸对照品，以甲醇补足，配制1.0mL的系列溶液，进行测定，计算回收率。

结果

3.1线性考察

回归方程为A=3635C + 55.1，r = 0.9996。结果表明，齐墩果酸的浓度在31.56μg·mL^-1～1010μg·mL^-1与峰面积有良好的线性关系。见图1。

3.2.1色谱适用性

根据色谱图得，齐墩果酸的保留时间为17.1min，其理论塔板数不低于2000，分离度为2.5。见图2。

3.2.2 精密度

如附表1所示，齐墩果酸峰面积的RSD=1.4%，表明该方法有较好的精密度。

3.2.2 重复性

经计算齐墩果酸峰面积的RSD =0.2%。说明本法的重复性较好，无系统误差。见表2。

3.2.2 稳定性

由色谱图可计算得齐墩果酸的峰面积RSD =2.3%。说明齐墩果酸在48h内稳定。见表3。

3.2.4 回收率

2倍稀释的样品溶液中齐墩果酸含量为70.24μg·mL^-1。见附表4，由回收率结果可知，本方法无系统误差。

3.3 含量

齐墩果酸的平均含量为77.33 mg·g^-1。

3.4 比较试验

如图3所示，川木通对照药材（1）及四批川木通药材（2、4、5、6）的最大吸收峰为280nm，关木通药材（3）的最大吸收峰为315nm，且在280nm处无吸收。

讨论

1 分别考察了以超声提取、盐酸水解、先超声提取再盐酸水解以及超声提取盐酸水解后氯仿萃取四种制备样品液的方法，进样并检测，结果以超声提取再酸水解法制备的样品液中齐墩果酸的含量最高。

2 实验中考察了梯度洗脱和等度洗脱，分别选用三个甲醇-水梯度系统以及不同比例的甲醇-水等度系统，分别以215nm和280nm波长检测。结果于215nm检测，以甲醇-水等度系统洗脱时获得的图谱最理想。

3 以甲醇-水（0.5%醋酸，0.2%三乙胺）为流动相，其中三乙胺可改善峰形，冰醋酸可产生弱酸性环境，既能使齐墩果酸峰形对称，抑制其拖尾，又能与其他成分达到基线分离。此外，考察了在30℃、35℃、45℃使齐墩果酸的分离，结果柱温越高分离越好，但不稳定，综合考虑选择35℃。

4 线性关系考察中，1:64倍液和1:128倍液未检测出，说明本试验中的齐墩果酸检测限较高，可能由于本试验的提取方法还不够好，有待于进一步的研究和改进。

5 通过将川木通与关木通的紫外吸收图谱进行比较，发现两种图谱明显不同，川木通在280nm初有最大吸收，而关木通最大吸收波长为315nm，本法对区分两种药材简单易行，可防止混用。

结论

超声提取盐酸水解的提取方法获得的齐墩果酸含量较高；以高效液相色谱法检测，简便、准确可靠、灵敏度高，可用于测定川木通中齐墩果酸的含量，以确保该药的合理有效应用。用紫外色谱法可初步简单的区分川木通和关木通两种药材。

参考文献

[1] 张斌慧,余梅,杨斌.木通、川木通与关木通的比较鉴别[J].贵阳中医学院学报.2006，28(5)：37-38.

[2] 国家部药典委员会. 中国药典. 一部.北京：化学工业出版社,2005：25，43.

[3] 肖培根. 新编中药志,第3卷[M].北京：化学工业出版社,2002,686.

[4] Chen YF,Liu J,Davidson RS,etal. Isolation and structure of clematine,a new flavanone glycoside from Clematis armandii Franch[J]. Tetrahedron ,1993,49(12)：5169.

[5] 黄文武,孔德云,杨培明. 小木通木脂素成分研究[J].中国天然药物,2003,1(4)：199.

[6] 国家食品药品监督管理局. 关于取消关木通药用标准的通知.广东药学[J],2002,(12)6：66.