主题：【分享】PCR不必“摸条件”

PCR反应液：

组成成分  50 μL体系 

2× MasterMix 25 μL
上游 Primer（10 μM 1-5 μL
下游 Primer（10 μM） 1-5 μL
模板

  lamid DNA  ～50 ng 
genomic DNA  ～1000 ng
cDNA    ～500 ng
粗提液  ～2 μL
灭菌蒸馏水至
50 μL

PCR扩增实例：

一 plasmid DNA扩增：
1．提取的质粒DNA扩增
以pUC19质粒为模板扩增100，250，500，1000，2000 bp片段，以pBS质粒为模板扩增1500 bp片段。


模板：pUC19质粒30 ng/50 μL or pBS质粒30 ng/50 μL

PCR扩增程序：

循环数 Step 温度 时间
1 1 94 ℃ 2 min
35 1 94 ℃ 45 sec
2 55 ℃ 45 sec
3 72 ℃ 2 min
1 1 72 ℃ 5 min



2．质粒菌液直接扩增：
以pUC19菌液为模板扩增100，250，500，750，1000 bp片段，以pBS菌液为模板扩增1500 bp片段。



模板：菌液OD600=0.8时2 μL /50 μL
PCR扩增程序：同上a扩增程序同。

结果：Bioteke 2×power Taq PCR MasterMix试剂对于质粒或菌液均可高效率的扩增。取扩增产物10 μL用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析可见明亮条带。

．genomic DNA扩增
1．大肠杆菌DNA扩增



模板：大肠杆菌DNA 50 ng/50 μL

PCR扩增程序：

循环数 Step 温度 时间
1 1 94 ℃ 4 min
35 1 94 ℃ 45 sec
2 58 ℃ 45 sec
3 72 ℃ 1.5 min
1 1 72 ℃ 5 min


2．高GC含量的片段扩增
a．人类基因组扩增（GC含量>60%）


   
模板：人类基因组 100 ng/50 μL
Primer：        PrimerF：5′-GGGAGGGGACCGGGGAACAGAG-3′
                PrimerR： 5′-GAACAGTCCGTCACTTCACGTG-3′
PCR扩增程序：

循环数 Step 温度 时间
1 1 94 ℃ 4 min
35 1 94 ℃ 45 sec
2 60 ℃ 45 sec
3 72 ℃ 1.5 min
1 1 72 ℃ 5 min

b．菌Streptomyces phaeochromo gene的片段扩增（GC含量>70%）
提取菌Streptomyces phaeochromo gene进行PCR扩增


模板：菌Streptomyces phaeochromo gene 100 ng/50 μL
Primer：71%GCPrimerF：5’-CCACCGGCCGCAGAGCAC-3’
71%GCPrimerR：5’-AGACGAGTCCCTTGGTTGGTAGC-3’
74.3%GCPrimerF：5’-CTCATCGTCGGCGCCGTCCTGGTC-3’
74.3%GCPrimerR：5’-CGGTCGGCTCGCTCCTGCTCTTCC-3’

PCR扩增程序：
循环数 Step 温度 时间
1 1 94 ℃ 4 min
35 1 94 ℃ 45 sec
2 55 ℃ 45 sec
3 72 ℃ 1 min
1 1 72 ℃ 5 min

结果：可见Bioteke 2×power Taq PCR MasterMix试剂对于原核或真核生物DNA均可高效。相较于同类的taq mix的扩增效率更高，且对于高GC含量也可得到很好的扩增。取扩增产物10 μL用1%琼脂糖凝胶电泳如图可见明亮条带。

三 cDNA扩增
人类胎盘提取的总RNA反转录的cDNA扩增1.2 kbp片段




模板：人类胎盘提取的总RNA反转录的cDNA 200 ng/50 μL
Primer：  PrimerF：5’-ATGGGCCTGGACATACAGAGCCTGGACA-3’
  PrimerR：5’-ATTCGGAGATGACCCTCAGGGATGGCTT-3’

PCR扩增程序：
循环数 Step 温度 时间
1 1 94 ℃ 2 min
35 1 94 ℃ 45 sec
2 64 ℃ 45 sec
3 72 ℃ 1 min
1 1 72 ℃ 5 min


结果：取扩增产物10 μL用1%琼脂糖凝胶电泳可见清晰条带。

四 粗提液扩增
  1. 人类头发粗提液扩增
    对人类头发及血液等进行扩增时，通常的做法是将头发中的DNA抽提出来再进行基因分析，但该方法的DNA纯化步骤非常烦杂。这里探讨将头发经过裂解后直接作为样品的扩增实验。
操作流程：将采集到的1根男性毛发毛囊用70％乙醇洗涤一次；用蒸馏水冲洗毛发两次；在PCR管中加入15 μL裂解液65 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min；将PCR管短暂离心，取4 μL裂解产物作为模板进行扩增



模板：人毛发粗提液4 μL
Primer： PrimerF：5’-TCCACTTTATTCCAGGCCTGTCC-3’         
PrimerR：5’-TTGAAATGGAATGGGAACGAATGG-3’   

PCR扩增程序：

循环数 Step 温度 时间
1 1 94 ℃ 4 min
35 1 94 ℃ 30 sec
2 55 ℃ 30 sec
3 72 ℃ 30 sec

1 1 72 ℃ 5 min


2. 植物粗提液的扩增

部分实验室里经常进行植物的实验，从植物中抽提DNA作为样品进行PCR分析是个很繁杂而且费时的过程。在这里探讨用简便的一步法将植物组织处理后取其上清作为模板进行扩增分析的方法。

操作流程：截取1-2片0.5-0.7 cm的小麦叶片放入1.5 mL 离心管中，加入100 μL溶液L，确保叶片浸没在溶液中；95 ℃ 10 min；加入100μl溶液I；Vortex混合。取2 μL做模板扩增。



模板：植物粗提液2 μL
PCR扩增程序：同毛发程序同。

结果：采用本方法，以人毛发及小麦的粗提液为模板扩增，取扩增产物10 μl用1%琼脂糖凝胶电泳可确认到明亮的条带。

非常详实的数据，多谢分享了

学习了，感谢分享！