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主题：【分享】Westernblot实验基础知识

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发表于：2011/04/16 11:47:21 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
一.实验步骤 
1. 组织块称重 
2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 
3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 
4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 
5. 移入离心管4℃ 约20,000 g（约15,000转）15分钟 
6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 
7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 
8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 
9. 沸水浴中3分钟 
10. 上样 
11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 
12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 
13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 
14. Westernblot 试剂盒显色 
15. 分析比较记录 
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2011/4/16 11:48:01 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
western blot的实验步骤及注意事项的资料 
1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 
2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。 
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。 
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 
5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 
2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 
3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 
4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 
5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 
6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 
7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 
8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 
9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 
10. 将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 
11．按步骤9洗涤。 
12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS），于室温下摇动。
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2011/4/16 11:48:30 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
注意事项： 
western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 
Western可以参考如下步骤进行操作。 

1.收集蛋白样品(Protein sample preparation) 
可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚 
细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒 
进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。 
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要 
采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生 
产的Western及IP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。 

2. 电泳(Electrophoresis) 
(1) SDS-PAGE凝胶配制 
SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配 
胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。 
(2) 样品处理 
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋 
白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)。 
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。 
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2011/4/16 11:48:56 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
(3) 上样与电泳 
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。 
为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。 
电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置 
或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求， 
也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在 
100V，然后设定定时时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。 
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适 
当分离后即可停止电泳。 

3. 转膜(Transfer) 
我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子 
夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。 
通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过 
夜。转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大， 
需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。 
在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。 
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春 
红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋 
白的残留情况。 
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2011/4/16 11:49:21 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
4. 封闭(Blocking) 
转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步 
骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 
用微型台式真空泵吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以在 
4℃ 封闭过夜。在整个Western过程中我们推荐使用碧云天生产的侧摆摇床，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋 
白膜。 

5. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 
参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。 
用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果 
不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。 
回收一抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤 
3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 

6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 
参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。 
用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 
回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤 
3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 

7. 蛋白检测(Detection of proteins) 
参考相关说明书，使用BeyoECL, Western 荧光检测试剂等ECL类试剂来检测蛋白。 
洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。 

8. 膜的重复利用(Membrane recovery) 
如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。
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2011/4/16 11:50:33 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 
分类
western显影的方法主要有以下几种：
1.放射自显影
2.底物化学发光ECL
3.底物荧光ECF
4.底物DAB显色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 
 
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2011/4/16 11:51:05 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
主要试剂
1、 丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。
2、 十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、 分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。
4、 浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.
6、 SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。
8、 转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。
9、 丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸 30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。
10、 脱脂奶粉5%(w/v)。
11、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
12、 Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
13、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、 过氧化物酶标记的第二抗体。
15、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。
16、 BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。
17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
18、 100mmol/L NaCl。
19、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。
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2011/4/16 11:56:40 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
在硝酸纤维素膜上制备组织印迹

1．在塑料板上放置两层Whatman 1号滤纸，在滤纸上方放上一张普通纸，然后铺上一层硝酸纤维素膜。

2．用双面刀片从植物组织如大豆的茎上切取一块切片（厚度约为1mm）。如果组织表面是湿的，则在Kimwipes纸上轻轻吸干或用蒸馏水洗涤几秒钟然后再用 Kimwipes纸吸干。用镊子将组织切片转移到硝酸纤维素膜上，注意一旦将切片放置在膜上以后就不得再移动切片。在切片上放置4层Kimwipes纸，用手指轻轻压15到20秒，用镊子小心拿开纸和组织切片。组织切片经甲苯酸蓝染色后观察其解剖结构。

3．将留有组织印迹的硝酸纤维素膜在空气中晾干。

4．将留有印迹的膜面向下，放入载玻片上的一滴甲苯酸蓝溶液中，对组织切片进行染色。2～3分钟后，吸干多余的染料，用间接照明立刻照相。将载玻片翻转，透过玻璃拍摄染色的组织切片。在切片上粘上几张纸片以免组织切片接触显微镜。

用特定的抗体检测组织印迹中的蛋白质（室温下）

1．在浅碟子里倒入30～40ml洗涤缓冲液I，清洗留有印迹的硝酸纤维素15分钟。

洗涤缓冲液I：

0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)

0.05%叠氮化钠

0.3％ Twen-20

2．将膜转移到15ml印迹缓冲液中，培育3小时。

3．把膜转入10ml用印迹缓冲液稀释的初级抗体溶液中，培育2小时。

4．在40ml洗涤缓冲液I中清洗硝酸纤维素膜10分钟，换上新鲜缓冲液，重复清洗3次。

5．将膜转入10ml用印迹缓冲液稀释的与碱性磷酸酶结合的二级抗体溶液中，培育1小时。

6．在40ml洗涤液I中清洗硝酸纤维素膜10分钟。

7．在40ml洗涤缓冲液Ⅱ中清洗硝酸纤维素膜15分钟，换上新鲜缓冲液，重复清洗1次。

洗涤缓冲液Ⅱ：

0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)

0.05%叠氮化钠

0.3% Tween-20

0.05%十二烷基硫酸钠

8．在40ml洗涤缓冲液I中清洗硝酸纤维素膜10分钟，然后用AP缓冲液平衡10分钟。

AP缓冲液

0.1 mol/L Tris-HCl (pH9.5)

0.1 mol/L NaCl

5 mmol/L MgCl2

9．在显色反应中，将膜放入10ml含有66μl氯化硝酸蓝四唑和33μl 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸的AP缓冲液中，两者均为碱性磷酸酶底物。目的蛋白所在处将出现紫色。通常显色10分钟即可获得满意的结果。如果需要更长时间的显色反应，必须在黑暗中进行。

10． 在20ml洗涤缓冲液Ⅱ中清洗硝酸纤维素膜5分钟，终止显色反应。用40ml蒸馏水洗涤5分钟后在空气中晾干。

11． 在解剖显微镜观察组织印迹中被染上色的蛋白质。利用透射光和入射光可成功的观察到蛋白质的定位模式。在入射光下可容易观察到物理印迹。为了确认组织印迹中的蛋白质定位，建议将染色的组织印迹和用甲苯酸蓝染色的组织切片进行直接比较。
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2011/4/16 13:35:02 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:
一、原理
二、 分类
i.放射自显影
ii.底物化学发光ECL
iii.底物荧光ECF
iv.底物DAB呈色
三、 主要试剂
四、 主要步骤
五、 实验常见的问题指南
1.参考书推荐
2.针对样品的常见问题
3.抗体
4.滤纸、胶和膜的问题
5.Marker的相关疑问
6.染色的选择
7.参照的疑问
8.缓冲液配方的常见问题
9.条件的摸索
10.方法的介绍
11.结果分析

一、 原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
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2011/4/16 13:35:42 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
二、分类
western显色的方法主要有以下几种：
i. 放射自显影
ii. 底物化学发光ECL
iii. 底物荧光ECF
iv. 底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 


三、主要试剂
1、 丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。
2、 十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、 分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。


4、 浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/LHCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.
6、 SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。
8、 转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。
9、 丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸 30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。
10、 脱脂奶粉5%(w/v)。
11、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
12、 Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
13、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、 过氧化物酶标记的第二抗体。
15、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。
16、 BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。
17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
18、 100mmol/L NaCl。
19、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。
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2011/4/16 13:44:14 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
western操作步骤，简单实用

1．制胶及上样：
（1）配制12%SDS-PAGE分离胶，混匀后注入边条厚度为2mm的两块洁净玻璃板间，其上加一薄层异丙醇，室温下静置至凝固。
（2）待分离胶完全聚合后，倾去其上的水层，以吸水纸吸净残余液体，插入加样梳，缓缓加入浓缩胶，使其充满加样梳间的空隙，室温下静置。待胶完全聚合。
（3）将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽加入电泳缓冲液。
（4）小心拔去加样梳，使加样孔竖直，以电泳缓冲液冲洗加样孔数次。
（5）分别取50µg蛋白量的细胞总蛋白样品及蛋白质分子量Marker，按4：1体积比加入5´样品缓冲液，以1´样品缓冲液？配平上样体积（总体积20µ1）后，于沸水浴中煮3min使蛋白变性。
（6）将处理好的样品按照预定的顺序加入分离胶的上样孔中。
2．电泳
（1）接通凝胶电泳仪的电源，初始电压70V。（约30分钟）
（2）溴酚蓝染料的前缘进入分离胶上缘后提高电压至160V，继续电泳直至溴酚蓝泳出分离胶的下缘。（约60分钟）
3．转膜
（1）从玻璃板中取出凝胶，将其浸泡于转移缓冲液中。
（2）取与胶同样大小的硝酸纤维素膜，以95%乙醇浸泡5秒钟后浸泡于转移缓冲液5分钟以上待用。
（3）按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、三层滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、三层滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。
（4）将转移夹放入转移槽，膜在正极、胶在负极，接冷却循环水，90V稳压转移2小时。
4．染色
（1）将硝酸纤维素浸入丽春红使用液中，振摇染色5-10min。
（2）蛋白质条带出现后，用去离子水洗去硝酸纤维膜上的丽春红底色。
（3）按照蛋白质分子量Marker指示的位置剪下目的条带所在的硝酸纤维素膜。
5．封闭


把硝酸纤维素膜浸入5%脱脂奶粉，室温摇动2小时。
6．洗膜与杂交
（1）以T-TBS洗膜，10分钟´ 3次。
（2）第一抗体封闭： SPARC单抗以T-TBS 1：200稀释，按0.1ml/cm2加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中，去除所有气泡，4℃振摇过夜。
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（3）以T-TBS洗膜，10分钟´ 3次。
（4）第二抗体封闭：辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG抗体（1：4000），按0.1 ml/cm2加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中，去除所有气泡，室温下振摇60分钟。
（5）以T-TBS洗膜，10分钟´ 3次。
7．化学发光与曝光
（1）将化学发光试剂盒中的两种试剂各取0.5ml，按1：1的比例混合，在暗室中与硝酸纤维素膜摇动孵育1分钟。
（2）用滤纸沾干膜上的液体，用保鲜膜包好，用感光胶片在压片盒中曝光约1分钟。
（3）曝光后的感光胶片在显影液中显影约30秒钟，定影液中定影1分钟，用水冲洗后晾干。
（4）根据曝光情况调整曝光时间，重复压片、显影及定影，选择满意的胶片。
（5）重复实验三次。
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