7) 加入0.75mL buffer PE 至柱子,室温放置2-5min,然后13000rpm*1min 离心
8) 取下柱子,弃流出液,再次13000rpm*1min 离心
9) 将柱子放置在一支新的1.5mL 离心管中,加入50uL EB buffer (或无菌H2O)
至膜中央,静置片刻,然后13000rpm*1min 离心,然后测定浓度
2.4 连 接
在连接反应中通常要求: (目的基因分子数:载体分子数=3:1)
连接反应体系
sample + -
10*T4 buffer 1.00μl 1.00μl 1.00μl
PGEM-T (50ng/ul) 1.00μl 1.00μl 1.00μl
目的基因(150ng/ul) 1.00μl 1.00μl /
T4 连接酶 0.50μl 0.50μl 0.50μl
补水 6.50μl 6.50μl 7.50μl
于16℃连接过夜。或室温(25℃)1 小时以上。
2.5 感受态细胞制备及转化
2.5.1 CaCl2 制备感受态细胞(DH5α 、DH10B、TOP10 )
1) 接过夜菌 在15ml 试管中加入3ml LB 培养基,从平板上挑取一单克隆接
种,37℃,260rpm,培养过夜,约16 小时。
2) 接菌 取2ml 过夜菌接入200ml 新鲜的LB 培养基, 37℃,260rpm,培
养,直至OD600=0.4-0.5(一般约2 小时),然后将菌液冰浴30-60 分钟。
3) 收菌 4℃,5000rpm×5min,弃上清。
4) CaCl2 悬浮 若50ml 菌液收菌,用10ml 0.1M 的CaCl2 轻轻吹打,充分悬
浮,冰浴10min。
5)离心 4℃,5000rpm×5min,弃上清。