主题：【分享】HPLC柱十大误区

误区一：HPLC柱不可反冲

否。通常液相色谱柱的设计的耐压值远高于最大操作压力（大约2倍）。因此

，对于稳定的填料床，如果使用合适的流动相和合理的时间分配，填的好柱

子能够左右开弓。反过来使用HPLC柱的原因有以下几点：换柱时反冲，清洗

柱头强吸附的物质，以及冲洗出残留物质防止压力增大。

但是有一个特例，如果厂家在柱头使用了大粒度的填料，反冲会冲出这一部

分填料。通常而言，出口处的填料粒度要比整支柱子最小的还要小。比如标

称5μm的粒度，实际粒度在3-7μm，则出口处的粒度必须比3μm要小，这才

能够保证柱子末端的填料不会被冲出去。

那么为什么厂家要在入口和出口处使用不同粒度的填料呢？因为大粒度的不

容易堵，比如0.5μm的柱子比起同样2μm的柱子更容易堵塞。因此为了避免

压力的快速升高，就要生产出更加有容差，大粒径填料入口的柱子。

博主注：柱子能不能反冲从我一开始接触就遇到了，有时候不管能不能，若

是进过了脏东西，非要这样做不可，因为不可能让它沿着柱子跑一遍，费时

费钱。实际上，能不能反冲直接决定于填料床的模型和实际填料到底有什么

“添加剂”在里面，而这些资料waters，agilent，Phenomenex是不会给我们

的。经验表明，反冲效果最好的是菲罗门，手上的不论是luna还是Synergi，

都能够这样，其中一支更是创下了实验室反冲柱的神话–正过来寿终正寝，结

果反过来又起死回生，用了接近一半的寿命。

误区二：所有的C18（L1）柱都相同

否。早期HPLC体系中，C18是唯一的反向色谱的键合固定相，因此C18就作为

了反向色谱柱的标准并且许多先行者也乐于使用。因为医药工业最先采用

HPLC，并且管理机构也不愿意厂家搞出新花样。FDA和USP也给出了提交新药

品应用时设计的分析方法分类。给予了C18的HPLC柱子分类为“L”，因为C18

色谱柱大部分作为提交新药的方法柱，C18就成为了L1，就是第一个标准柱。

但更多的固定相出现，就以新的L值命名。（L7=C8，L10氰基，L11苯基）。

问题来了，因为商品化的C18合成条件不同，使用的不尽相同的作硅胶基体材

料，就导致了反向柱有不同的性能。比如说：有的厂家使用一氯甲基硅烷，

和小表面积的硅胶（如图），又有的使用同种硅烷，但是键合在大表面积硅

胶上。这样就会导致大表面积的更像C18。低键合相优势会有未反应的硅醇羟

基，能够导致混合的样品保留机理。所以厂商就使用二氯或者三氯硅烷，可

以使硅烷流动属性降低，键合相就会薄一些。而为了使没有反应完的硅醇羟

基消失，厂家就用小烷基封端来屏蔽（如三乙基氯硅烷）。硅醇基是中pH条

件下简单化合物拖尾的始作俑者。所以许多厂家使用了双封端技术，就是用

第二个小的硅烷来获得更加惰性的表面。厂家也使用了聚合物材料作为基体

，然后多多少少键合C18，这就导致了柱子C18总量参差不齐，但依然还是作

为C18（L1）来作为标准柱。也有的使用纯烷基硅烷键合，那么就表现出不同

的反应特性，提供了与氯硅烷不同的C18键合相条件。

所以呢，此C18非彼C18在今天看来特别有意义。龙生九子，子子不同，因此

用户分析开发的时候需要一致的柱子来获得稳健的方法。研究人员也开始研

究哪些C18有类似的保留特点和选择性。所以就发现有的C18便显出完全与C18

相反的特性。

博主注：只知道C18悠久，没有想到这么早，一般认为封端的就好些，比如大

连国产的那个，用着用着柱效下降很快，我就认为和这个键合啊，封端啊有

关系。

误区三：保护柱不影响分离效果

否。首先，配一个保护柱很好。如果固定相选择错误，保护柱也能够对分离

有效果。要明确的是：保护柱是保护分析柱避免被高残留的组分污染用的，

尤其是那些不想进让它柱子的部分。保护柱比起分析柱便宜许多，所以污染

的保护柱能够替换的更加勤。

理想的结果是，保护柱的固定相和分析柱恰好相同。如果固定相保留强（如

高载碳量和混合相），就能够使得保留便宜而影响分离，甚至导致不同的选

择性。如果保留弱，问题就不那么明显，除非固定相影响整个体系选择性。

为了使保护柱最小化的影响分离，保护柱需要合适的装配。显然，保护柱安

插在进样口和分析柱之间，但是如果管路太长（太长或者内径太大），就会

造成额外的峰展宽，从而影响分离。系统引入整合保护柱，从以往的报道看

，基本上会达到分析柱的最佳水平。但是，整合保护柱基本上和卡式色谱柱

捆绑，因此不是那么流行。从操作的角度说，应当在不影响HPLC系统的前提

下容易卸下和更换。

理论上，如果保护柱延长了柱长，那么就对色谱分离有额外的塔板数。但就

像前面说的，保护柱要么在最佳条件使用，要么在最糟糕的条件下除去。所

以保护柱的优势就是延长柱寿命，而没有带来总体分析效率的提高。

博主注：最早接触保护柱，或者叫预柱，实在接触waters设备的时候，两个

圆圆的盖子，仪器标配，缺点是不锈钢管路还那么长，简单的保护部分被拉

出一大截死体积，后来菲罗门也送保护柱过来了，千把来块钱，一直放着也

没有用，说句实话，笔者不是很喜欢用这个做保护，原因就在于觉得影响效

果。

误区四：提高温度往往有利于分离效果

否。随着温度升高，流动相粘度下降，因此分析物传质速率提高，所以就能

够提供更好的色谱分离效果。正确，但是除了柱效，温度同样影响保留因子

（k）和选择性（α）。影响因素能够提高分辨率（其实这也是色谱分析最关

心的问题），或者降低分辨率。保留时间往往随着温度升高而降低，因为温

度作为一个热力学参数，使得高温度下分析物倾向于留在流动相中，会更快

的洗脱出来。但是，不同的化合物，也有可能对于温度有不同的保留程度改

变。以analgesics(一种镇痛药，译者注)为例，图二。这一系列的色谱图列

出了分析物在柱温20-90°C的情况。我们从中可以发现许多特点。首先，所

有分析物随着温度升高，保留时间减低且峰变窄，意味温度升高利于分离效

果。其次，salicylic acid（水杨酸即阿司匹林，译者注）在峰5，6之间，

随着温度位置改变较大。事实是在20-40°C时，该物质随温度变化，洗脱顺

序也发生了变化。所以，温度大于40°C会引起分离时间变短和洗脱顺序变化

。

当然，一个提高温度的好处在于降低了操作时的柱压，以便于使用更大的柱

流量和更细的填料。

另一个在高温下能够因此柱效的实验参数是流动相的热力学不匹配（互溶问

题，译者注）。如果柱子在60°C下操作，但是流动相在室温流入，那么进入

的较冷的流动相就能够引起峰变形，原因是不同温度下分析物会趋向在高温

的流动相中。所以建议大家使用恒温柱子的时候一定记得流动相要预热。

博主注：温度对出峰时间的影响是显然的，武汉这边的夏天热，液相色谱室

这边一般都不愿意把门关上，所以空调以往这边吹，出峰就靠后，waters，

agilent 一般没有配柱温箱，varian，岛津的喜欢推广这个，对于稳定保留

时间很有作用。不过我觉得平常的实验室，流动相怎么放，色谱柱也怎么放

，不然就像上面说的，流动相里的分析物经不起温度的折腾。毕竟不论DAD（

PDA）还是UV测得是浓度，变形了测得就不太准了，0.15%很容易突破的。

误区五：碳载量越高，反向色谱柱就越好

否。谈到烷基键合相是，这样的结论肯定是对于链长、载碳量和表面积等有

概念误解。通常，真正的反向机理是，保留取决于分析分子的疏水性质，所

以保留一般取决于载碳量。载碳量越高，保留越长。载碳量一般与链长对应

，但有时候不是。典型的硅胶反应的硅醇含量在8.0 μmol/m2左右，用来键

合有机硅试剂。如果对于一个每平方米微孔相同的单层键合相，给定的表面

范围，链长越长，载碳量就越大，最终的结果是保留与链长一致。但是对于

短链键合相（比如C8），如果基体变面积大，那么键合的碳就会更多，就会

可能导致比C18更加长的保留。此外，厂家使用二硅烷和三硅烷，以及聚合物

基体也能取得较大的表面积，所以短链聚合相就会在这种情况下带来单联键

合所不具有的表面积。对比单体键合相，有时候上述的这些聚合物基体的键

合表层较薄，引起传质较慢。

高载量的反向柱更加容易坍塌和反润湿。对于这些柱子，当环境水样中的机

修饰剂降到10%的时候，类油的疏水固定相就会变得自我关联（self-

associate），而不是作为极性溶液（即相似相溶）。所以，在此情况下，高

碳载量理应并不利于反向色谱也不利于色谱重现性。

博主注：卖主子的公司都喜欢谈论这个指标，什么资生堂，迪马的柱子在介

绍的时候碳载量是放在显著的位置的。平心而论，碳载高的柱子制造难度大

，同时分析我手上小分子的时候还真是好些，目前还没有发现碳载高的柱子

塌掉的情况，可能做的还不够多吧。

误区六：使用小粒径的分析效果好

　　否。对于一个装填优秀的色谱柱而言，随着装填粒径的减小，柱效提高

，但是如果附加柱（应该指保护柱，或者冗长的管路系统 译者注）对色谱系

统对谱带展宽影响足够明显，那么，色谱柱的粒径影响就不容易发觉。这些

附加柱效应影响列举如下：
1. 进样体积，包括进样环，以及进样阀的额外体积
2. 管路体积，包括从进样阀（器）出口到色谱柱入口
3. 保护柱的间隙和适配器
4. 在线过滤器体积
5. 色谱柱入口到色谱填料之间的一段距离的体积
6. 色谱柱间隙体积
7. 色谱柱色谱填料到出口的一段距离的体积
8. 色谱柱出口到检测器入口的管路体积
9. 检测器入口到流通池的管路体积
10. 流通池体积
　　上述均为附加体积（就是死体积，介绍的比较全面 译者注）。因此，能

够做的就是把进样量最小化，保持色谱柱入口前的管路尽可能短，内径尽可

能小。如果色谱柱出口到检测器的管路合计1米长，内径0.5mm，谱带展宽就

会完全影响色谱分离效果。所以，想要在小于2μm或者1.0mmde 微孔柱上得

到好的效果，就要要保持“附加柱”尽可能的短。
　　博主注：与其使用更好的柱子，还不如优化下色谱体系。每每

拿到柱子就看一下柱子验证报告，不论是国内厂商，还是老美，这个报告我

都是深信不疑的，如果拿了同样的标样做不出来，那最可能的原因就是系统

没有优化。人家出厂测试的时候，管路都是尽可能的短，尽可能的细，流动

相是尽可能的纯，没法比，但至少自己优化了比没有优化还是有区别的。

误区七：对于硅胶填料，硅醇基是拖尾的原因</strong>

　　否。在特定场合，出现在硅胶基键合柱上的硅醇基，尤其是分析碱性化

合物，能够造成拖尾。拖尾的原因在于硅醇基团就是一个弱酸，pKa大约在

4.5和4.7之间。因此如果流动相pH值在4到5的时候，硅醇就会离子化，与正

电荷分子离子反应，比如通过静电作用于氨基的H反应（Si-O-----H-N 译者

注）。该反应可以通过减小pH到3阻止离子化来减小。但是对于许多碱性化合

物，在低pH条件下也能够发生拖尾。而对于碱性化合物的拖尾，要得到好的

峰形，就需要特别设计的反向色谱柱了。
　　
三种原因能够造成拖尾，化学问题（之前已经讨论过），柱填充问题，

色谱设备硬件问题。三种问题都可以造成拖尾，但是要解决问题，就需要找

到问题的根源。详细的讨论需要千言万语，所以这里就只给出解决问题的大

概方向。首先，与硅醇基的反应问题，化学因素的拖尾能够用多种方式表现

出来。早期色谱柱，可以发现金属螯合剂能够和柱子中痕量金属反应。因此

，错误的进样溶剂就能够导致拖尾（-CN 螯合，译者注）。使用比流动相强

的溶剂进样也能够导致峰扭曲。（如甲醇配样，乙腈做流动相 译者注）。拖

尾还可能来自于柱头处，样品中不容易洗脱出的物质，和流动相的杂质。这

些物质能够与不同的固定相反应，然后在分析物经过的时候发生影响（杂质

占位，不保留 译者注）。流动相混合模式偶尔也能够诱发拖尾（应该指的是

四元单泵 译者注）。分析物与固定相作用，离子化合物与活性基体作用。有

时候，流动相pH错误，样品部分离子化，就能够导致峰扭曲和拖尾。此外，

色谱背景峰上的小峰，看上去也有点拖尾。
　　
柱子的填充质量也可以导致拖尾。柱头的填料空隙可以导致分叉或者拖

尾。如果柱子没有填充好，有凹槽（可以是硅胶上的小洞， 译者注）就能够

因此峰形过宽。样品含量过大会导致拖尾（一般是后拖前不拖）。如果进得

少了，因为柱子上过度的硅醇反应，也能够导致拖尾。
　　
第三个来讨论下仪器硬件问题。前面说的管路死体积（extracolume）和

接头体积能够导致拖尾。进样口的瞬间加压可以造成柱子和流动相之间的空

洞从而加剧拖尾。反应比较慢的检测器用来检测快速洗脱出的分析物时会形

成峰展宽和拖尾（和流通池厚度，长度有关 译者注）。前文中说的柱操作温

度和流动相温度不匹配自然也会引起。
　　
所以，造成HPLC拖尾的不总是硅醇基。
　　博主注：液相色谱天生的峰就宽，比不上GC或者电泳，看着就

羡慕，谁叫它是靠压力在水里走呢？柱子里走的路径不同，还有空隙里中间

快，靠边的慢，相比之下，就是正常的峰形，都觉得有些拖。把硅醇封端不

光是为了防拖尾，还有个作用就是防坍塌，用个小基团在C18、C8后面顶着，

柱子也耐用一些。

误区八：硅胶填料只能够在pH2到7使用
　　通常有两种HPLC反向柱的化学退变机理：在低于pH2的时候硅氧键催化水

解；在pH大于7或8的时候，被水中-OH溶解。pH小于2的时候，-Si-O-Si-可以

被H3O+进攻，固定相就会流失断裂。随着时间的推移，随着载碳量下降保留

值会慢慢下降。这种情况在由三甲基硅烷等短链封端的色谱柱时，应当尤为

注意。长链C18固定相因为空间位柱效应，对于这样一种流失有一定的保护作

用，但是最终仍然是慢慢被侵蚀，尤其是温度高于环境时。空间保护、密度

图层键合固定相有助于防止硅胶键合相的流失。聚合物固定相在这种条件下

表现良好，但是比起硅胶固定相的柱效要低。
　　在高pH方面，一定需要有保护硅胶基体免于羟基进攻的措施。一旦溶解

过程开始，随着固定相被掏空，色谱柱会最终失效。所以开发了双硅烷交联

C18（bidentate C18），杂交等耐高pH的特种色谱柱。这些柱子都使用了化

学方法来保护固定相避免羟基的洗脱。上述的特种柱子能够承受pH11-12的条

件。在此碱性，pH条件下，柱子要避免高温使用。当然，聚合物色谱柱能够

在pH13甚至14的条件下使用，但是，前文已经指出，聚合物柱比硅胶柱效果

要差些。
因此，在这个论点上，硅胶柱能够在pH2-7以外的范围使用，但是普通硅胶色

谱柱要格外小心，由其是在高温条件下。
　博主注：再一次提醒自己，pH的使用是液相色谱的精髓之一。

怎么调节，物质在等pKa的pH条件下出峰时间中等，碱性在高于pKa，酸性低

于pKa时保留时间延长，峰形也漂亮，反之出峰快，峰形不好说。除了这个，

估计什么都要靠运气了。

误区九：当代HPLC柱至少应该承受1000次进样

　　否。现代HPLC色谱柱能够承受的进样数量由许多因素决定。有些因素基

于以下模式：反相色谱，离子交换色谱，排阻色谱，正相色谱，手性色谱，

亲水交互色谱等等。有些因素基于不同的填料基体：硅胶基质，杂交基质，

氧化皓基质，聚合物基质等填料，或者是基于不同的硅胶软硬程度和涂层的

交联程度。有些因素基于固定相本身：空隙率，键合方式，聚合，单层键合

，或者包埋方式。其他的因素就和条件有关了：pH，温度，流动相组分，缓

冲组成，流动速率，压力等等。还有些和样品有关：完全标样，洁净样品，

样品pH，样品体积（含量），样品杂质，分析物分子本身特性等。
　　如果一根柱子被滥用，比如在pH范围外，或者流速范围外，很有可能连

50次进样都成问题。如果每次样品都没有什么杂质，5000次使用也不为过。

如果色谱柱不总是在其承受力上限使用，寿命会更长。如果柱子进入多种多

样的样品，但是从来不冲洗柱子里的残留，寿命必然减少。
　　笔者（原作者 译者注）对于许多制药公司的经验表明，绝大多数5μm反

向色谱柱在分析物质结构，简单药品混合物，和标样的情况下能够承受至少

1000次测试。如果样品“很脏”，比如没有严格完全的净化生物样品提取物

，环境样品提取物，1000次进样是有待考验的。
　　所以说柱子能够承受的次数不是绝对的，而是取决于柱子的类型（本身

体质和适用范围 译者注），操作条件，样品洁净程度和滥用程度。即使有些

仪器能够记录柱子的使用，实际上只有不到15%的研究人员记录了色谱柱能够

用的次数，很多研究人员都不知道到底能够用多少次
　　博主注：用仪器的都知道要保养，奈何就是有人把过粘，过脏

的东西一针一针的往里打，这样的惨剧博主不是第一次见了：纯的油质，黄

黑色的，20μL，卡嚓一针进了六通阀；50uL当5uL的针装在自动进样器上，

不设延迟时间，直接卡嚓往GCMS里面搞，还要不要仪器了，要不要人活。所

以说，样品要接近，溶剂要过膜超声。

误区十：色谱柱总是应该紧紧的密封，以防被填料被空气破坏

　　否。通常色谱柱两头的小孔不到0.5mm，所以如此小的区域，空气进入色

谱和流动相蒸发很小。即使是一个小气泡进入色谱柱，也不能够有足够时间

来进入填料床，接触足够的固定相而造成损害。假若柱子中有了这么个小的

气泡，只要装在色谱设备上运行一次，在高压下会立即溶解，然后流出色谱

柱，不会有任何危害。当然，如果你为了保险，死死的拧紧也行。柱子也都

配备了螺纹柱塞（原文是 male compression fitting caps, 英文的这个传

神，翻译不出来那个感觉，罢了 译者注），手动就能够拧紧，以防止溶剂蒸

发，空气进入填料。