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主题：【讨论】提问帖（5.17）色谱柱填料的孔径，对样品的分析分离有什么影响（答案已出）

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dahua1981
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2012/5/17 14:46:54 11楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
孔径大小影响峰形！300A填料分析大分子物质的样品时可以明显改善峰形！比方说蛋白质，多肽！
但是不一定改善分离，相反孔径越小，分离度一般越好！
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2012/5/17 14:47:56 12楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
孔径，指的是硅胶表面上的小孔的直径，是一个平均值。常规的液相色谱柱都是在硅胶表面健合特定的官能团，孔径的大小影响官能团健合的密度。同等粒径的硅胶，孔径越大，硅胶的比表面积越小，硅胶表面健合的官能团密度越低，也就是C%越低；反之，孔径越小，比表面积越大，官能团健合的密度越高。另外，如果用来分离生物大分子，就要选择孔径较大的(例如300A)的填料，这样才会得到充分的保留。
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dahua1981
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2012/5/17 14:52:23 13楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
柱填料

大多数用于HPLC分离的柱填料使用硅胶微粒（作担体）。基于多孔聚会物担体或其它材料的色谱柱也已商品化，这些非硅胶填料由于有其特殊的应用，以后再作讨论。由于硅胶担体与键合的有机表层（如C18或C8），应用范围广，我们将作重点讨论。

图5-1所示为HPLC中常用的几种微粒类型。由于全多孔微球很好地兼顾了众多理想的性质：效能、样品荷载量、耐久性、方便性以及有效利用率等，所以最为常用。这些微粒有不同的粒径、孔径和表面积供选择，所以用这些物质能建立各类HPLC方法。


图5-1的微粒类型（图示大致为所用微粒的相对大小）。



实心微球型微粒固定相有一实芯核，起作用的是其表面很薄的外壳。这些硅胶或聚会物基质的微粒，通常为1.5~2.5μm，因为其快速传质的动力学过程，对大分子有突出的福利效能。因为这些实心超小微粒的表面积较小，样品容量有限，所以仅适于分析型HPLC。这种超小微粒的色谱柱出峰极为尖锐（小体积），因此要求所用HPLC仪器的柱外峰展宽因素极小，以避免峰展宽。

灌注色谱填料包含孔径达4000~8000A0（艾）的贯穿孔，而且在这些贯穿孔网络中还有较小的内联孔（如300~1000A0（艾））。在高流速时，溶质可通过对流和扩散的共同作用，进入（并离开）该孔结构。其效果减少了峰展宽，所以大的多孔微粒在柱效方面与小微粒相当，但压力降却小得多。目前这种类型填料的使用还较少，因此，其实用性还有待于进一步探讨。不过，这种填料似乎非常适于大分子如蛋白质的制备分离，用于小分子的日常分析分离则较少。

颗粒大小（粒度）在HPLC中极为重要。约5μm的微粒直径很好地兼顾了分析柱的柱效、反压和寿命。更小的多孔微粒（如3μm）对快速分离很有用。小至1.5μm的薄壳微粒对极快速地分离蛋白质等大分子较有用。较窄的粒度分布（<±50%均值）能保证填充床的稳定、高效和压力降最小。总的说来，3或5μm全多孔微球填充HPLC色谱柱，能满足大多数分离的需要，我们推荐大多数的方法建立用这些粒度的色谱柱。

表5-1总结了HPLC分离用微粒的理想的物理特性，以及它们的重要性。一般使用7~12nm（70~120 A0（艾））孔径的全多孔微粒。表面积150~400m2/g的全多孔微粒分离小分子较有利。表5-2列出一些窄孔径C18商品柱的典型物理性质。对于分子量大于10000Da分子的分离，需用孔径大于15nm的微粒，使这些溶质容易进入到微孔结构内部的活性表面。各种情况下，都应保证溶质在微孔里能迅速扩散与柱效良好。孔径至少是溶质流体动力学直径的4倍，才能确保溶质的有限扩散不至于使柱效下降。大孔微粒的比表面积有10~150m2/g不等，取决于微孔直径的大小；孔径越大表面积越小。

表5-2 分析柱的理想的微粒特性



特性

用途


5μm全多孔微粒

大多数分离


3μm全多孔微粒

快速分离


1.5μm薄壳微粒

极快速分离（尤其是大分子）


±50%（均值的）粒径分布

稳定、重现、高柱效、柱压低


7~12nm孔径，150~400m2/g（小孔）

小分子分离


15~100nm孔径，10~150m2/g（小孔）

大分子分离

表5-2 一些C18色谱柱硅胶担体的物理性质



色谱柱

孔直径（nm）

表面积（m2/g）

体积孔隙率% （ml/ ml）


Hypersil ODS

12

170

57


LiChrosorb C18

10

355

71


Novapak C18

6

——

——


Nucleosil  C18

10

350

69


Symmetry  C18

10

335

66


Zorbax  ODS

6

300

5


Zorbax Rx，SB，XDB

8

180

50
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2012/5/17 14:54:35 Last edit by dahua1981
童话仙子
liling123436
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2012/5/18 21:42:55 14楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
俺太佩服俺师傅了，真心的佩服，就是个资料库呀
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yifan1117
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2012/5/19 8:40:22 15楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
填料孔径对分析对象的分子量有限制，当孔径为分析物尺寸的5倍以上时，分析物才能顺利通过孔隙，孔径处于60~120 Å的色谱柱适用于相对分子量小于10000的分析物，孔径为300 Å的色谱柱可以满足分子量处于10000以上的大分子化合物分析。
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yu3226033
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2012/5/19 11:45:47 16楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
填料的孔径太小，待测物不易流出，分析时间长，展宽严重；孔径太大则很可能导致组分分不开。在做凝胶色谱时，需要先大致估计下待分析物的分子量，然后选择合适的柱子，如果不知道粒径，可先用大孔径的先试试，接着再用小粒径的以达到更高的精度。市售的柱子上都有该柱适用的分子量范围，一般选待测物分子量在色谱柱的最大分子量的20%-80%为宜。
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2012/5/20 8:48:38 17楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
填料粒子的孔径及孔径分布，主要从三个方面影响反相色谱的色谱行为。首先，是孔径影响了粒子比表面积的大小，从而对配基的数量，即碳含量造成影响，它涉及到样品的负载量。其次，孔径的大小，从空间上必然对溶质的分子量大小有所限制。此外，孔的不均一性，及孔径分布，也会带来尺寸排阻效应。
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2012/5/20 8:49:59 18楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
孔径越小柱内的填料越多，在相同条件下，色谱柱的塔板越高；使用者根据检测或分离样品的分离度和检测时间，决定柱子的型号。简单说，在分离度达到要求的前提下，时间（色谱柱）越短越好；填料粒径越小，同样空间装填的填料越多，塔板也越高，柱压也越高。
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2012/5/20 8:54:46 19楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
填料的孔径大小及其粒径分布均匀性

孔径太小，待测物不易流出，分析时间长，展宽严重 。 孔径太大则很可能导致组分分不开 。 在做凝胶色谱时，需要先大致估计下待分析物的分子量，然后选择 合适的柱子，如果不知道粒径，可先用大孔径的先试试，接着再用 小粒径的以达到更高的精度。市售的柱子上都有该柱适用的分子量 范围，一般选待测物分子量在色谱柱的最大分子量的20%-80%宜
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2012/5/21 9:06:42 20楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
到目前才只有三个人参与了
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