(三)操作
(1)取层析柱1支(1.5cm×20cm),垂直固定在支架上,关闭下端出口。将已经溶胀好的Sephadex G-25中的水倾倒出去,加入2倍体积的0.0175mol/L,pH6.7磷酸盐缓冲液,并搅拌成悬浮液,然后灌注入柱,打开柱的下端出口,继续加入搅匀的Sephadex G-25,使凝胶自然沉降高度到17cm左右,关闭出口。待凝胶柱形成后,在洗脱瓶中加入0.0175mol/L,pH6.7磷酸盐缓冲液以3倍柱体积的磷酸盐缓冲流过凝胶柱,以平衡凝胶。
(2)凝胶平衡后,用皮头滴管除去凝胶柱面的溶液,将盐析所得全部IgG样品加到凝胶柱表面,打开柱下口,控制流速让IgG样品溶液慢慢浸入凝胶内。凝胶柱面上加一层的0.0175mol/L,pH6.7磷酸盐缓冲液,并用此缓冲液洗脱,控制流速为0.5ml/min左右。用试管收集洗脱液,每管10滴。
(3)在开始收集洗脱液的同时检查蛋白质是否已开始流出。为此,由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盘中,加入1滴20%磺基水杨酸,若呈现白色絮状沉淀即证明已有蛋白质出现,直到检查不出白色沉淀时,停止收集洗脱液。
(4)由经检查含有蛋白质的每管中,取1滴溶液,放置在白色比色盘孔中,加入1滴奈氏试剂,若呈现棕黄色沉淀说明它含有硫酸铵。合并检查后不含硫酸铵的各管收集液,即为“脱盐”后的IgG。
注意:在检测时,用皮头滴管吸取管中溶液后应及时洗净,再吸取下一管,以免造成相互污染假象。