主题：【分享】高效液相色谱技术

7.2 基本参数
1.    保留值
进样


          t0
                              tR
 
⑴保留时间“tR”：进样至出峰的时间。
⑵死时间“t0”：不被柱子吸附的惰性物质的出峰时间。死时间“t0”的测定通常是使用不被柱子保留而又有紫外吸收的惰性物质，例如：正相色谱常用四氯化碳，反相色谱常用甲醇、尿嘧啶、NaNO2、NaNO3等。
⑶容量因子“k’”：
        或：
  “k’”是比“tR”还常用的保留值，它与柱子的大小及流速无关，只与溶质在固定相和流动相的分配性质、柱温以及相空间比（即固定相和流动相之体企积比）有关。“k’”又定义为在分配平衡时某溶质在两相中绝对量之比，消除了保留值的波动因素，而平衡常数“K”是平衡时物质在两相中的浓度比。
k’值的范围：    0.4＜k’＜20～30    k’＝2～5为佳，过大则耗时太长。
⑷保留体积：VR＝tR•FC      ( FC --- 流动相的流速 mL/min )
    VR是在tR时间内流动相流过柱子的体积。
    调整保留时间：tR’＝ tR－t0
    调整保留体积：VR’＝ VR－VR0＝tR’ •FC
⑸选择性指标“α’”和相对保留值“α”
    α’可以更直观和方便地反映色谱峰分离的好坏：
        进样      tR(1)              tR(2)                           
                                                               

相对保留值(分离因子)：
    ( α＞1.1为好 )
2.    柱效率：
定义： 理论塔板数    ( 每米柱 )    1/2 h            2 
    标准偏差，曲线拐点处峰宽的一半                      W1/2
      即峰高0.607处峰宽的一半          1/2 h

为便于测量，改用半峰宽：
                                            Wb
W1/2( 或2×△t1/2 )
                           
最常用的计算式：
                   
另一计算式：
                   
  Wb不如W1/2容易测量，因而此式用的较少。
理论塔板高度：            L    柱长
经验式：
        H＝2dP    ( dP＝10μ  H＝20μ  N＝5万 )       
                    ( dP＝5μ    H＝10μ  N＝10万 )
            dP    柱填料的颗粒直径
柱效的测定和计算：
以反相柱为例，流动相用87％(V/V)的甲醇:水，样品用苯、联苯、萘等，加快记录仪的走纸速度，测出半峰宽W1/2，并由走纸速度换算为与tR相同的单位“分”或“秒”，代入公式，计算出柱效N。
提高柱效的方法：①固定相填料要均一，颗粒细，装填均匀。②流动相粘度低。③低流速。④升高柱温。
3.    不对称因子“Tf”：
用于形容色谱峰拖尾和前伸的程度，多数为拖尾峰。


h                                进样          进样 
        A  B
                          1/10h                                     
                                        拖尾            前伸

        A、B如上图所示
通常 Tf＝1.2～1.3 ，若 Tf＞2 则峰不合格。
峰拖尾的原因是硅胶基质上的Si－OH羟基未被全部键合而与溶质发生反应。
改进拖尾要用封尾技术：即用小分子的含甲基的物质再次对硅胶进行键合，封闭硅羟基；还可在流动相中加入带 –NH2氨基(对羟基敏感)的物质，将残余的羟基掩闭。

分辨率：                                            tR(1)              tR(2)           

                    进样                W1/2(1)      W1/2(2)
                           
                                                    tW1                tW2

4. 分离度 K1和 K3
HPLC的目的和要求是：峰要尽可能窄（W1/2小），峰的间距尽可能大（tR相差大）。
⑴基线分离度 K1 ：                 
         
基线分离时用K1。                  H
⑵峰高分离度：                                          h
         
    K3＝1 基线分离，K3 更反映了实际分离心度。
5.    线速度：溶剂在柱中移动的速度。
  mm/sec  L─柱长    t0 ─死时间  H(μm)                       
                                                              粗粒   
如右图所示，用实验可找到最佳的线速度：                           
即图中的A点：u＝1 mm/sec                                           
此处不用流量而用线速度，是因为流量与                                 
柱径有关，而线速度与柱径无关。                                             
请记住不同柱内径的最佳流量：                      A        u(1mm/sec)     
    柱内径        流量          线速度
      5 mm      1.0 mL/min      1 mm/sec
      2 mm      0.2 mL/min      1 mm/sec
      1 mm      50 μL/min      1 mm/sec
由1 mm/sec 最佳线速度可计算出适合各种柱径的最佳流量。
由上表可以看出，用5mm柱，一天要用一并昂贵的乙腈，若用1mm柱，则一个月才用一并。
6.    保留值方程：
正相色谱：    lnk’＝a＋blnCb＋cCb      Cb─强冲洗剂浓度
反相色谱：    lnk’＝a＋cCb          对于不同溶质 a、b、c 系数不同
离子交换色谱： lnk’＝a＋blnCb                反相色谱是线性方程



正相色谱：                        反相色谱：
  lnk’                            lnk’



                                Cb                            Cb




lnk’                              lnk’
                                                          萘
                  四氢呋喃/水
  D                      甲醇/水                    苯
 
                              Cb                  D      Cb (甲醇/水)
D点：同样的容量因子，四氢呋喃        D点：萘非极性强，k’大，斜率陡 
    用量少

lnk’          甲                    lnk’
   


                          乙
                  C  A  B      Cb                A  A D    A      Cb 

A点甲、乙二溶质分不开，B点比        A点分不开，要寻找不是交叉点的
C点冲洗剂浓度高，但k’小，省时        D点的Cb浓度为分离条件
间，所以选B点好。

所以，改变Cb浓度，保留值k’和选择性α都改变了，寻找最佳的Cb浓度就是HPLC
高效液相色谱技术的精髓所在。
例如，通常用10％～90％的甲醇/水，梯度洗脱30min，即可找出适宜的Cb浓度。
用高浓度Cb洗脱，可保证先将所有的峰都洗脱出来，不丢失组份，然后再调节Cb浓度，找到更好的分离效果，加大各组份色谱峰的分离度。
甲醇降低10％，k’可降低2～3倍。







7. 反相色谱的一般规律：

            样品

                          是          离子交换、离子对色谱
        是否离子型                  或从文献中挑选


                          是          反相色谱( C18或短链 )
            是否可离解                    70％甲醇/水，pH 6.0
                               

                否                    改变pH或改变甲醇/水                         
                                      百分比         
                                                                 
                                                                     
不知道                      是        反相色谱( C18或短链 )                   
极性是否很强                    30％～40％ 甲醇/水     


                            是        反相色谱( C18 )       
        是否中等极性                  50％～70％ 甲醇/水     


                            是        反相色谱( C18 )       
          非极性                      70％～90％ 甲醇/水     

                 
                                                               
                  反相色谱( C18 )                                             
                  梯度30％～100％ 甲醇/水                                             
                  或由100％ 甲醇开始分步洗脱                                     
                                                             





7.3  HPLC系统构成
 
            脱气    泵        进样伐      柱        检测器  收集器
                                                                           
                                                                     
                                                                       
                                                                       
                                                                         
                                                                                                                                       
    流动相贮液并          自动进样器      控制系统    数据处理系统

7.3.1 HPLC系统使用记录
1.    仪器使用记录：
⑴    各组件的牌号、型号、编号、购进日期、安装日期、保单。
⑵    标准参考条件的标准色谱图（流动相、流速、压力、温度、检测器参数、样品量等）：
反相色谱： 流动相：甲醇/水（70:30 V/V）
          柱：C18
          流速：1.0 mL/min
          检测器：UV 254nm
          样品：尿嘧啶（测t0）、苯酚、苯乙酮、硝基苯、苯甲醚、甲苯。
        ⑶ 使用记录：日期、工作内容、开机时间、样品数、仪器状态、操作者。
⑷ 维修记录：日期、原因、修理人、结果。（可备专用维修记录本）。
⑸ 换柱：牌号、种类、尺寸、标准色谱图。
⑹ 换部件：日期、原因、型号、编号、标准色谱图、操作人。
2.    个人实验记录
⑴ 日期、天气、室温。
⑵ 实验目的。
⑶ 色谱系统：厂名、型号等。
⑷ 操作条件：流动相（配比、pH、过滤脱气情况）。
⑸ 样品：予处理方法、进样体积。
⑹ 分析结果：数据、资料、色谱图。
⑺ 现象记录。
⑻ 参考文献。
3.    色谱柱记录
⑴ 原始记录：启用日期、填料种类、牌号、编号、标准色谱图（流动相、流速、压力、N、t0、tR、RS、Tf）。
⑵ 使用记录：仪器、样品、操作人。
⑶ 贮存记录：润湿溶剂、加盖否。
⑷ 维修记录：日期、原因、措施（补柱头、反冲、换板）。
⑸ 柱寿命：N、色谱图、操作人。
7.3.2 贮液器和流动相脱气
1.贮液器：常用干净的无水甲醇试剂并作贮液器，并要加盖以防灰尘落入，但并盖与导管之间应有缝隙，若过紧会形成真空。贮液并内要放置烧结不锈钢过滤器，即沉子，孔径为10μm，其作用是：①防止灰尘进入泵缸。② 作为进液导管的重物，使导管能沉在并底。
2.脱气：正相色谱如非水性凝胶色谱的流动相不必脱气，反相色谱的流动相需要脱气。
⑴ He氦气脱气：10min可以除去80～90％溶入的气体，但价格昂贵。
⑵ 真空脱气：这是最常用的方法，可用真空抽滤流动相的方法代替。
⑶ 超声脱气：使用方便，但只能脱气30％。
⑷ 加热回流：最彻底的脱气方法，混合流动相不能用。
4.    注意：
⑴ 溶剂过滤：常用0.5μm膜过滤。HPLC级溶剂：无微粒，无紫外吸收，已用
0.2μm膜过滤。
⑵ 贮液并要不定期更换，要有2～3个备用并，定期用酸、水、溶剂清洗。
⑶ 沉子：用三个月后必须清洗或更换，若未用沉子，则必须用0.5μm膜过滤。
⑷ 使用混合流动相时：易产生气体，可在系统外予混合后脱气。
⑸ 流动相不畅的原因：管路阻塞、长了霉菌、管道空化、贮液并盖子太紧。解决的办法有：抬高贮液并或向并内加压；去掉沉子；用稀硝酸洗去管道内微生物（洗前必须洗净醇类）。
7.3.3 色谱柱
    填料： 国产：天津试剂工厂：YWG─C18H37
      进口：Zorbax─ODS
常用柱尺寸：长25cm，内径4.6mm
注意事项：
1. 加流路过滤器与保护柱（予柱）：通常用3cm短柱，内径2mm。
2. 避免高压冲击：进样伐快转；泵起动时要由小流量开始。
3. 分离条件的选择：
pH：硅胶基质：pH 2.5～7.0，聚合物填料：pH 1～13 。极端pH的流动相能溶解硅胶。
温度：高温下用小颗粒填料柱会引起塌陷，柱效N下降一半：3μm柱，＞40℃；5μm柱，＞70℃。
4. 柱的保存：通常灌注纯有机溶剂保存。若用水（如凝胶柱），则加10％叠氮化钠。
5.    净化样品：①不含微粒；②防止蛋白质沉淀在柱头；③防止组分在固定相上保留
过强。
措施：先过滤样品；先做予试验（样品加入流动相中变浑否？）；用予柱除去强保留组分。若用6M NaOH 溶解的样品进样50～10μL，硅胶柱就报废。
    6. 定期洗柱：甲醇、乙腈洗掉柱中强保留组分，正向或反向洗，不要流过检测器，若无效：则换不锈钢过滤片，并用同种填料加乙醇调成糊状，补平柱头，或挖去2～3mm脏填料，重新填平（填料也可以不同种）。
7. 延长柱寿命：修补柱头；换不锈钢过滤片；冲洗柱；倒向用（柱效要下降
40～60％）。
7.3.4 泵─往复式恒流柱塞泵
三大问题：
    1. 单向伐故障：红宝石球与伐座密封不严。
      原因：⑴ 污染：气泡、微粒。
              解决方法：用25mL 水、甲醇、异丙醇、二氯甲烷 依次冲洗。在稀硝酸中超声15min ，用HPLC水洗2～3次、甲醇洗2次。
            ⑵ 磨损：对调红宝石球，使面密封变为线密封。
    2. 密封圈故障：渗漏、垫圈碎片污染系统。表现：压力不稳、泵头漏液。通常三个月或不定期换密封圈。拆泵头：兰宝石杆要缩至最短。
    3. 气泡：用脱气后甲醇冲洗。
予防措施：
    1. 用高质量溶剂和水作流动相。
2. 流动相脱气。
3.每天结束时：先用水洗，再用甲醇洗。若用过缓冲液：必须先水洗30～60min
（1ml/ min），再甲醇洗30min，千万不可先用甲醇冲洗，否则无机盐沉淀堵了管路。
    4. 及时换密封圈，加油。
    5. 用10mL水、10mL甲醇洗泵头排水孔。
    6. 防止柱塞杆磨损。换新圈仍漏，则是柱塞杆被盐划伤。
7.3.5 进样器
      分手动、自动两种，通常实验室用的是手动。
    六通进样伐：惰性聚合物转子与陶瓷定子之间构成密封面。
    内装式：针头插到伐体内的转子部位，平头，有直径0.5mm和0.7mm两种。完全装液法与部分装液法均可使用。
外装式：进样孔与伐有距离，部分样品留在进样管道，不被注入样品环管，因而最好使用完全装液法
注意：
1. 内装式平针头决不可过长，不可超出转子面，否则将损坏进样伐。进样后可不拔出针头，进样量不限。外装式进样量要过量，进柱样品量精确度比内装式高。
    2. 转手柄要快：＜1秒，不允许仃在中间！
3. 用后要立即清洗：
  使用了强腐蚀性溶剂：用水和有机溶剂清洗。
使用了含盐缓冲液：用后立即用水洗净进样孔和导管，否则会损坏密封面。
4. 针头不可过细，否则针头密封圈失效而渗漏。
7.3.6 检测器
    检测器的作用是将浓度的变化变成电信号。
1.    紫外检测器：
195～350nm 的可变波长检测器通常使用氘灯。1024个二极管的二极管阵列检测器可作吸光度、时间和波长的三维检测，画出三维立体山峰形状的图形。
      石英流动池为“Z”形，约8μl，光池为1mm×10mm。
注意问题：
⑴ 氘灯寿命只有 400～1000小时，要注意节灯。
⑵ 气泡：谱图上出现许多毛刺峰，是光池内有气泡，可用脱气后的甲醇或异丙醇冲洗。
⑶ 污染与堵塞：反向冲洗顺序为：50ml无水乙醇→50ml水→250ml 3M硫酸→100ml水。为防止酸喷出，可用反向负压回抽法（用注射器）。
⑷ 正确选择检测波长：通常用该样品紫外扫描吸收光谱的波峰波长。
2.    荧光检测器：将溶质样品衍生为荧光物质，检测灵敏度比紫外高10～1000倍。
3.    示差折光检测器：灵敏度较低，用于糖类样品的检测。

由于上述帖子中有许多图片丢失，会影响阅读，请下载附件。

资料不错，谢谢

还好，有附件，适合我这种初学者看啊，哈哈

原文由 arvid2007(arvid2007) 发表:
还好，有附件，适合我这种初学者看啊，哈哈

您还是初学者太谦虚了啊！

很不错，经典的理论知识！

收藏学写了