主题：【第六届原创】等度梯度你会选择谁？

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houjjun

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发表于：2012/12/22 20:56:52 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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等度梯度你会选择谁

液相色谱法中常会提到洗脱方式，大家通常提到的洗脱方式一般分为等度洗脱和梯度洗脱两种。

等度洗脱是指实验过程中（做样过程）从头到尾只用一种流动相。也就是只用一个泵，输送同一种流动相。

梯度洗脱是指在同一个分析周期中随着时间的变化按一定程序梯度性地改变洗脱液的比例(浓度配比、成分、离子强度、溶液极性等)或pH，以期将层析柱上不同的组分洗脱出来的方法。从而可以使一个复杂样品中性质（极性）差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。梯度洗脱一般分为二元高压梯度，二元低压梯度和四元低压梯度；二元高压梯度需要两台高压泵，二元低压梯度和四元低压梯度都是只需要一台高压泵和一个比列阀。

配置特点：

1. 等度洗脱只需要配置一台高压泵，配置相对简单，成本低；

2. 二元高压梯度洗脱需要配置两台高压泵，一个混合器及连接管理，配置较高，成本高；

3. 二元低压梯度洗脱需要配置一台高压泵、一个二元比例阀、一台在线脱气机、一个混合器（脱气机和混合器视情况而定，可不选）及连接管路，配置较低，成本较低；

4. 四元低压梯度洗脱需要配置一台高压泵、一个四元比例阀、一台在线脱气机、一个混合器（视情况而定，可不选）及连接管路，配置较高，成本较低。

梯度洗脱配置相对复杂，现主要介绍下梯度洗脱的原理及洗脱要求：

梯度洗脱的原理

具体地讲，当样品随梯度起点的流动相进入色谱柱入口时，由于起点流动相中弱洗脱溶剂A含量较高，强洗脱溶剂B含量较低，化合物C1(保留性适中)和化合物C2(保留较强)因分配系数(k值)较高而滞留于色谱柱入口附近，几乎未移动。一段时间后，B增加到一定数值，C1的k值达到足够小(比如小于10)，其在柱中的移动速率明显增大，并且随着B的增加，其移动速率愈加快速，直到tC1时流出色谱柱，被检测器检测到并被记录成色谱峰C1，tC1虽然比等度时的保留时间长很多，但C1的的平均k值却很小，因而色谱峰并未展宽，灵敏度仍处于较高水平。B持续增加，在随后的某个时间点，C2的k值也降到10以下，C2的移动速率也开始变快，以与C1类似的方式于tC2被洗脱出色谱柱，其平均k值同样很小，色谱峰亦未展宽，灵敏度处于较高水平。

流动相的梯度变化即流动相极性、PH值等的梯度变化，即洗脱能力成梯度变化。

洗脱要求

① 洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使各峰完全或基本分离；

② 梯度的上限（强洗脱溶剂的比例）要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。

③ 梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。

优缺点：

1.等度洗脱优点：流速不发生变化，压力稳定，实验结果准确、可靠；

缺点：多组分检测或有杂质干扰情况下分离度可能会差，而且不容易优化，对于某些复杂样品分析时间长，峰形差。

2.二元高压梯度洗脱优点：每台泵的流速都由程序控制，a.多组分检测或有杂质干扰情况下提高分离能力，b.缩短某些复杂样品的分析时间，c.改善峰形，减少拖尾，d.提高柱效，增加检测灵敏度；

缺点：a.流速变化得由程序控制，有时会出错,b.压力可能会不稳定，c.混合时可能会产生气泡，影响基线噪声及漂移，d.高压混合时可能会产生热量，e.对混合器要求很高，如果混合不好，基线噪声和漂移会很大，f.由于流动相比例发生变化，基线可能会漂移，g.实验准确度、稳定性没有等度高，h.故障率高于等度。

3.二元低压梯度优点：只需一台泵一个比例阀，就能达到梯度洗脱效果；

缺点：低压混合可能会产生气泡，梯度稳定性和准确度不高。

4.四元低压梯度优点：只需一台泵和一个比列阀，就能达到梯度洗脱效果，并且同时可以控制四种流动相；

缺点：低压混合可能会产生气泡，需要加在线脱气机，梯度稳定性和准确度不高，对比列阀要求很高，梯度滞后体积大。

检测要求：不同物质（所测物质）分离度一定要好，峰形要好，分析时间要短，稳定性、准确度尽量高，实验成本尽量低等等。

配置建议：

采样高效液相色谱法实验时，对仪器的配置一般尽量简单。仪器配置复杂后，操作就会复杂，稳定性、准确度可能会受影响，故障率就会高，使用成本也会高。在能达到较好的分离度及峰形的情况下能用等度就用等度；
同时检测多种复杂成分，或是有干扰物的情况下，为达到满意的峰形、分离度、分析时间，就得使用梯度洗脱方式了。各种成分可以使用不同比例的流动相进行洗脱，如农残检测、氨基酸检测等。要求高的话采用高压梯度洗脱，要求低的话采用低压梯度洗脱。
流动相种类相对简单的话采用二元低压梯度洗脱，相对复杂的话（如洗脱时需要四种不同溶液的流动相）采用四元低压梯度洗脱。

等度梯度洗脱各有优缺点，在采用高效液相色谱法实验时，你会选择谁？

以上内容均属于个人观点，如有不足之处还请多多指点！