主题：【分享】单细胞凝胶电泳标准操作规程(

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发表于：2013/05/12 11:41:28 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

关键词：单细胞凝胶电泳
目的：为便于各室单细胞凝胶电泳试验结果的可比性
背景知识：略
原理：在细胞核中，DNA是环状附着在核基质上，细胞裂解过程中，核基质被溶解、抽提，DNA的结构则未发生变化。如果DNA链上存在缺口，则使DNA超螺旋变的松弛，DNA环向外展，同时由于暴露了阴电荷，在电场力的作用下，松动的DNA环向阳极迁移，但是由于这种松动的DNA环一端仍附着于核DNA，其迁移距离受到限制，因此尾长并不总是真实反映链缺口的多少。实际应当依靠尾长与尾部的荧光强度同时来进行分析。
主体内容：操作步骤见下文
主要参考文献：略

操作步骤：
1. 分离制备单细胞悬液：
（1）体外培养的细胞株：用胰酶消化，吹打成单细胞悬液
（2）体内脏器细胞：处死动物，取出脏器，于Hanks’液中制备成单个细胞悬液。
2. 胶板制备：
（1）取20~50μl于56℃水浴中保温的0.5%普通熔点琼脂糖，铺于磨沙载玻片上，形成底胶。
（2）取100~150μl 0.5%普通熔点琼脂糖加在底胶上，再于其上加盖玻片，4℃冷凝10分钟。
（3）取下盖片，取50~100μl于37℃水浴中保温的1.0%的低熔点琼脂糖与50~100μl细胞悬液（105个细胞/ml）混匀，立即铺片，加上盖玻片，4℃冷凝10分钟。
（4）去掉盖玻片，取70~100μl于37℃水浴中保温的0.5%的低熔点琼脂糖铺片，加盖玻片，4℃冷凝。
3. 细胞裂解与电泳：
（1）将制备好的胶板去掉盖玻片后，浸于4℃预冷的细胞裂解液中，4℃裂解1小时。
（2）取出胶板，放入电泳槽中，浸泡在电泳液中解旋20分钟。
（3） 4℃电泳20分钟（25V，300mA）。
4. 中和与染色：
（1）电泳结束，将胶板浸泡于中和液中，每次15分钟，共中和两次，注意更换中和液。
（2）取出胶板，置于染色架上，滴加5μg/ml的PI，暗处染色20分钟。
（3）蒸馏水脱色15分钟。
5. 镜检和分析：
（1）在荧光显微镜下观察，绿光激发吸收滤片590nm。必要时照相记录。
（2）记数观察的细胞，记录彗星细胞出现的频率，用目镜测微尺测头长与全长，计算核DNA迁移距离。

* * * * *
使用两层凝胶法，经裂解、DNA解旋、电泳和中和得到湿琼脂糖凝胶片。将湿琼脂糖凝胶片置于冰冷无水乙醇中脱水10分钟，后置于空气中自发干燥。每人制备2张琼脂糖凝胶片。全部操作在采血后8小时内完成，操作过程中注意避光。脱水干燥的琼脂糖凝胶片装于含有干燥剂的载片盒中运回实验室。使用50μl 30μM的溴乙锭溶液染色、照相。使用单细胞凝胶电泳软件分析所有照片，每人随机测量100个以上细胞的尾长和olive尾矩，以尾长和olive尾矩的算术均数代表个体DNA损伤情况。

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