最近看了篇文章：The cleaning and regeneration of reversed-phase HPLC columns
觉得写得挺不错的，想到让实验室的同事自己来看原文不太现实，就想着把它翻译过来的。经过一周的努力，终于弄完了，现分享给大家，方便有需要的朋友参考。
另外，原文可以在这里下载：http://www.instrument.com.cn/download/DownLoadFile.asp?id=20468&huodong=2
这次我也会把原文和译文一起都发一下，欢迎下载，鉴于原文有相应的表和图以及参考资料，在译文中我就都省掉了，如要了解更清楚，请参考原文信息。
此外，有些地方翻译不出来或不太明白，我也用红色标注出来了，希望能够得到大家的指导，谢谢！
拙文，请勿见笑。
反相高效液相色谱柱的清洗与再生
RonaldE. Mayors, Agilent Technologies, Wilmington DelaWare, USA.
本月的”ColumnWatch”
介绍一些实用的使被污染的色谱柱性能恢复或接近恢复至初始水平的方法。Ron Majors
也会讨论一些键合硅胶和其他类型的反相色谱柱的清洗方法。迄今为止，反相色谱是高效液相色谱中使用最广泛的技术，它能普及的原因是其能适用于绝大多数非极性化合物，很多可解离和离子化合物的分析。反相色谱中使用的固定相大多是天然存在的疏水化合物，因此，被分析物因它们与固定相之间相互作用的不同而被分离开来，同时，极性表中疏水性接近的化合物也表现出相似的色谱行为。表1
列出了与硅胶键合的最常用的固定相，固定相的亚种，比如混合固定相（如苯基-
已基混合），终端封尾以及其变种和极性包合固定相也被统计在了这些硅胶键合相之中，多种其他包合材料也被用在了反相色谱中，包括高分子聚合物，聚合物包裹硅胶，氧化铝，无机-
有机混合物和石墨化碳。第一种固定相都有它的优势和不足。反相色谱柱被用于多种使用各种流动相和添加物的应用中，有一些应用中使用的添加物会改变填料的表面性质，有时这些添加物本身硅胶会污染填充物表面或键合相。由于疏水键合相的存在，键合硅胶颗粒的表面会有一些特性。残留的硅醇会存在于所有键合硅胶颗粒的表面。图1
显示了硅醇可能存在的多种形式。在弱酸性环境中，这些硅醇能和特定的化合物和基质成分特别是碱性化合物发生相互作用。因为硅醇的PKa
大约为4.5
，在中等PH
条件下会发生解离，因此有可能与阳离子组分发生静电相互作用。传统的A
型硅胶的金属离子含量会很高（有时高达100ppm
甚至更高），这些金属离子会将酸性更强的物质引入到硅胶表面中，也会与金属螯合物或清洁剂发生相互作用。残留硅胶对非终端封尾和像C2
或C4
这样的短链键合相的影响会更大。用户必须清楚他们所使用的固定相的表面性质以及被分析物与固定相表面的相互作用，这样在他们开发和使用反相方法时，就可以把这些因素考虑进去，例如，像玉米油，高级芳香化合物和蜡这样的样品基质会粘附在反相填料表面并改变其性质，含有蛋白质成分的生物样品也会吸附在填料颗粒表面，即使分析师采用最好的方法来避免外来物质的污染以保护色谱柱，最终待分析物-
基质仍然会影响固定相。色谱柱在被污染后，它的色谱表现会不同于未被污染的色谱柱。本期的”Column Watch”
会介绍一些使色谱柱恢复或接近恢复其初始状态的实用方法。由于硅胶键合色谱柱使用最广泛，我会特别重点介绍这一方面，在本文结束的时候，我也会讨论其他类型的反相色谱柱的清洗规程。反相色谱柱是如何被污染的？
通常，样品基质中会含有一些与目标分析物无关的物质。在使用过程中，盐，酯类，脂肪化合物，有机酸，疏水蛋白和其他生物组分是一部分可能与色谱柱发生相互作用的物质。与目标分析物相比，这些物质的保留能力可能更强，保留能力较弱的化合物，如盐，通常在死体积内被冲出色谱柱，这些预料之外的干扰可被检测器检测到，表现为色谱峰分叉，基线波动甚至是负峰。如果样品基质成分在色谱柱上的保留能力很强，而流动相的洗脱能力从来都没有强到足以将这些化合物冲出来，那么在多次进样后，这些吸附在色谱柱上的基质组分就会聚集，当足够多时，它们就会像新的固定相一样表现出性质，被分析物与这些污染物的相互作用会影响分离机制，可能导致保留时间波动和峰拖尾。如果污染物更多，则柱压可能升至很高的水平，甚至超过柱压上限，也可能造成色谱柱坍塌并形成死体积，这取决于堵塞形成的位置。冲洗硅胶键合色谱柱
复原一根被污染的色谱柱的关键是知晓污染物的性质并找到能够将其清除的适当的溶剂。当污染来自于重复生进样后强保留物质的积累时，一些简单的能将这些物质清除的处理方法通常能恢复色谱柱的性能。有时用相同的操作，即用20
个柱体积的90%~100%B
相（双通道色谱中洗脱能力更强的溶剂）冲洗色谱柱。表2
列出了多种规格的色谱柱柱体积，这样读者在用非水溶剂如甲醇，乙腈或四氢呋喃冲洗色谱柱时就能很容易确定适当的冲洗体积。如果你的流动相为缓冲盐溶液，不要直接过渡到强溶剂，直接过渡到高浓度的有机溶剂会使缓冲盐在HPLC
流路系统中析出结晶。这会导致更严重的后果，比如筛板堵塞，接头连接处堵塞，柱塞杆初始化失败，柱塞杆磨损或进样阀转动失败。相反，用5~10
个柱体积的不含缓冲盐的流动相（即用水来替代缓冲盐）冲洗色谱柱后就可以用洗脱能力更强的溶剂来冲洗色谱柱了。很多时候，流动相中洗脱能力更强的溶剂仍不足以清除色谱柱上的污染物，这时为了清除色谱柱上的污染物就需要使用一种或多种洗脱能力更强的溶剂了。如果这些污染物是非生物性的，那么使用者可以用一种或多种有机溶剂来冲洗色谱柱以清除掉这些污染物。可以使用的溶剂或混合溶剂有很多种，可访问一家或数家色谱柱生产厂商的网站以获取各种关于溶剂系统的建议和提醒。总体而言，所有的清洗过程都遵循相似的原则，即所使用的溶剂的洗脱能力越来越强，常常以一种极性非常低的溶剂（比如乙酸乙酯甚至是碳氢化合物）结束，这种溶剂对清除像蜡类，油酯这样的非极性化合物很有帮助。确保冲洗过程中任何相邻的两种溶剂的混溶性是非常重要的。在冲洗完后，应当用适当的溶剂过渡后再使用初始流动相来冲洗色谱柱。举个例子，异丙醇就是一种优良的过渡溶剂，因为它既可以与像正已烷或二氯乙烷这样的有机物混溶，也可以与水溶性试剂相混溶。由于异丙醇的粘度很大，注意控制其流速以免系统压力超过压力上限。同时，如果使用了紫外检测器，则应避免使用在紫外区有吸收的溶剂，否则就需要用大量的溶剂来清除掉这些溶剂以得到稳定的基线。对于普通的硅胶键合色谱柱并且使用的流动相中不含盐时，可用下面的程序进行清洗：·100%甲醇·100%乙腈·75%：25%乙腈甲醇混合液·100%异丙醇·100%二氯甲醇和·100%正已烷如果使用二氯甲烷或正已烷冲洗了色谱柱，由于溶剂的不相溶性，在恢复至水溶性流动相之前，必须用异丙醇过渡。每一种用来清洗色谱柱的溶剂至少需要10个柱体积，对于规格为250mm×4.6mm的分析柱来说，分析员可以用典型的1~2ml/min的流速来进行冲洗。为了恢复至最初使用的流动相，分析员没有必要将清洗时的整个程序反着来一遍，建议使用异丙醇过渡，然后用不含缓冲盐的溶液，最后使用最开始的流动相来冲洗色谱柱。四氢呋喃也是一种常用于清洗污染色谱柱的溶剂，如果用户怀疑存在严重污染，也可以用二甲亚砜（DMSO）或二甲基甲酰胺与水以50：50比例混合，然后以小于0.5ml/min的流速冲洗色谱柱，成功的反相色谱柱再生是一个特别耗时的过程，可以在夜间来运行这种梯度冲洗程序。有一个值得考虑的问题是在冲洗过程中能否反冲色谱柱。由于绝大多数保留能力强的组分通常保留在色谱柱柱头，因此，反冲色谱柱可以大大缩短污染物离开色谱柱所需经过的距离。这时就需要考虑填充柱柱床的稳定性了，大多数现代的色谱柱是在比日常使用压力更高的条件下充填的，因此，它们的柱床通常不会被反冲的溶剂所影响。然而，如果前端筛板的孔径比后端大，这种反冲显然是不恰当的，举个例子，如果后端筛板的孔径为2μm，就足以拦截住平均粒径为5μm（粒径差异在±2μm）的柱填料颗粒，但有些厂商为了防止样品或流动相中的微粒堵塞前端筛板，就使用了更大孔径的前端筛板，如果这种孔径比粒径分布曲线上最小的填料颗粒大，那么显而易见，在反冲时有一些填料会穿过前端筛板离开色谱柱，以至形成死体积。如果色谱柱上有一个箭头来指示流动相方向，那么在反冲这根色谱柱之前，我会查看手册，技术指南，官网或咨询技术支持团队以确定能否反冲这根色谱柱。无论你是否反冲色谱柱，为了避免色谱柱上的污染物或颗粒进入流通池从而污染检测器，请断开色谱柱与检测器之间的连接。对反相柱进行柱清洗的频率取决于强保留性物质进入到色谱柱的多少。由于反相柱在表现出分离度下降或释放异常物质之前能够耐受住较大量的污染，因此，用户趋向于等观察到异常后才会注意。然而，更多污染物的聚集会使清洗工作变得更为困难。基于这个原因，如果你知道有的脏样品进入色谱柱中，我建议你对色谱柱进行定期清洗，你清洗的频率越高，你所需的清洗程序就会越简单。冲洗反相键合硅胶柱的残留蛋白质
如果生物杂质比如血浆或血清在反相色谱柱上聚集，为了清除这些物质，色谱工作者必须使用不同的冲洗程序。在大多数情况下，像乙腈或甲醇这样的纯有机溶剂难以溶解多肽和蛋白质，因此，对冲洗反相柱是无效的。然而，有机溶剂与缓冲盐、酸，有时也可以是离子对试剂形成的混合溶剂是有效的。开始的时候，应该试图使用更高比例的流动相中洗脱能力更强的溶剂（溶剂B）来冲洗色谱柱。Freiser和合作者发现反复使用不同比例的三氟乙酸水溶液与三氟乙酸-异两醇溶液来冲洗色谱柱也可以再生色谱柱。Bhadwaj和Day发现对于规格为250mm×4.6mm的色谱柱，进100μL的三氟乙醇也会有作用。如果这些努力都失败了，那么为了清除蛋白质，可以使用Cunico和同事建议的洗脱能力更强的溶剂和增溶剂（见表3）。然而，在用这些试剂冲洗色谱柱之前，请参考色谱柱说明书或向厂商咨询以确认色谱柱能够耐受这些试剂。通常以硅胶为基质的色谱柱是能够耐受的，但是以高分子聚合物为基质的色谱柱在与某些溶剂接触后，这些聚合物可能会发生溶解或膨胀，继而使色谱柱性能受到影响。在使用上述溶剂冲洗色谱柱时，请确保相邻的两种溶剂是混溶的，丙醇是一种优良的过渡溶剂。每一种用来冲洗色谱柱的溶液至少使用20个柱体积。有一些溶剂的粘度很高，需要适当调整系统流速以免压力超过上限。在使用含胍或尿素的试剂冲洗色谱柱后，应该再用至少40~50个柱体积的色谱级纯化水来冲洗色谱柱。对于反相色谱柱，不建议使用诸如十二烷基磺酸钠（SDS）和聚乙二醇烃醚之类的清洁剂。因为这些物质本身会牢牢地吸附在键合硅胶填料上以致很难被清除掉，清洁剂会改变填料的表面性质。然而，Separations Group的研究表明，被合成多肽的保护基团和降解产物污染的色谱柱可以通过在流速为1ml/min的条件下进100μL的1%SDS的方式进行清洁，如果随后使用含有0.1%三氟乙酸（v/v）的乙腈以5%-95%的梯度冲洗色谱柱并在最后用初始流动相对色谱柱进行平衡，那么色谱柱对多肽的分离能力就可以恢复。一些特殊的用来清洗反相键合硅胶柱的方法
有时用有机溶剂无法清除掉色谱柱上的污染物，当硅胶或键合相上有金属离子吸附时尤为如此。这时，可以使用金属螯合剂比如0.05M乙二胺四乙酸（EDTA）来冲洗色谱柱。EDTA可以与很多金属离子结合并清除它们，在用EDTA处理后，分析员就可以直接用水来冲洗色谱柱了。如果样品中含有离子化合物，那么通过改变PH使它们变成非解离状态，就可以用水和有机物的混合液来将其冲出色谱柱了。举个例子，有些碱性很强的化合物可以通过将PH值调到3以下的方式来清除，在这种条件下，质子化氨（NH4+）的水溶性会更好，同样，对酸性化合物也可以通过将PH值大约调到8~9（高于PKa）以使它们处于离子状态。<这个举例很奇怪，前文说通过调节PH值以使化合物处于非解离状态，然后将其清除，举例却都是调整到解离状态。也许都对吧，解离时用水的比例更大的流动相，而调到非解离状态就用有机相比例更高的流动相了。>然而，必须注意的是长期暴露在高PH环境中会损坏以硅胶为基质的色谱柱。为了控制可能存在于缓冲盐系统或因失误而被保存在缓冲液中的色谱柱中的细菌的生长，色谱工作者可以将家用漂白剂稀释10到20倍后，用至少50个柱体积的稀释液来冲洗色谱柱，然后再用50个柱体积的色谱级纯化水来冲洗色谱柱，不要让漂白剂通过检测器，因为它会损坏流通池。要抑制溶剂瓶中细菌的生长可下措施：·每次只使用够用的量并将其他的保存在冰箱中；·可以向缓冲盐中加入0.1%的叠氮化钠；·不要让色谱柱中的缓冲液长时间不流动。色谱学家经常讨论离子对试剂对应用于离子对色谱中的色谱柱固定相的影响，很明显，像辛烷磺酸（用于阳离子）和溴化四烷基铵（用于阴离子）这样的离子对试剂在有一定金属离子存在的条件下，能够牢固的吸附在键合硅胶色谱柱填料的表面，于是这根色谱柱就被污染了，性能也无法再恢复至初始水平。这点表明，任何被用于离子对色谱中的色谱柱不能再用于常规的反相色谱分析中。Bidlingmeyer不认同上述观点，并认为将更极端的PH条件用于离子对色谱中的确能够改变一些色谱柱的性质，无论是通过在强酸性（PH1~3）条件下键合相或终端封尾硅胶的水解还是通过硅胶在更高PH值（PH8~9）条件下的溶解的方式。为了清除离子对试剂磺酸，他建议先用不含离子对试剂但其他组成与原流动相相同的流动相冲洗色谱柱至少20个柱体积，然后再用不含缓冲盐的流动相来冲洗色谱柱（在这一步中，有机溶剂用甲醇代替乙腈会更好，对于长链离子对试剂，则用四氢呋喃），显然，离子对试剂磺酸与离子对试剂铵盐表现出不同的色谱行为。Bidlingmeyer和同事们的研究表明当流动相中甲醇的比例超过70%，作为长链离子对试剂的十二烷基磺酸钠不会保留在C18色谱柱的固定相上，这一发现与Separations Group的结论相吻合。键合硅胶相的整体柱，如Chromolith columns(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)应该被作为一种特殊的硅胶基质色谱柱并以不同的方式进行处理。高分子聚合物色谱柱的再生
被用来分离生物样品分子的聚合物色谱柱也会被污染并需要清洗。通常认为聚合物材料的一个优点就是它们的化学稳定性。事实上，很多厂商也建议用1.0M HNO
3或1.0M NaOH
来冲洗他们的色谱柱。有些反相聚合物色谱柱，比如those packed with poly (styrene-divinylbenzene)(PS-DVB) beads and polymeric monoliths such as CIM RP-SDVB discs (BIASeparations, Ljubljana, Slovenia) and Swift columns (Isco, Lincoln, Nebraska,USA)能够耐受较大范围的PH
值（通常是pH 1~13
有时甚至是pH 0~14)
。但在使用强有机溶剂冲洗这些色谱柱时，用户应该注意这些色谱柱的填料暴露在某些有机溶剂中会发生膨胀或收缩，其程度取决于聚合物的交联度。通常交联度高于8~10%
的高交联度聚合物物理稳定性较好，在水溶液中的收缩和有机溶剂中的膨胀都很小，在用一系列溶剂冲洗聚合物色谱柱之前，查询色谱柱使用手册或向生产厂商的技术支持团队寻求帮助是该提倡的。根据BIASeparations
的建议，用户可以通过以下程序来再生由PS-DVB
生产的以聚合物为基质的整体柱：·用含有0.1%三氟乙酸的异丙醇以日常使用流速的一半的流速冲洗色谱柱至少10个柱体积·用流动相中的B相以日常使用流速的一半的流速冲洗色谱柱至少5个柱体积·用至少10个柱体积的流动相中的A相以日常使用流速来平衡色谱柱如果一根含有丁基或乙基的甲基丙烯酸酯整体柱被冲洗干净了，那么残存的蛋白质沉淀就可以被反冲出来。所用的试剂是1.0M NaOH溶液，水，20%乙酸溶液和日常分析时所使用的缓冲液，每一种试剂冲洗10个柱体积。对于疏水性更强的蛋白质，用户应该增加一步，就是在用水冲洗后再用30%（v/v）的异丙醇或70%（v/v）的甲醇来冲洗。为了清除或抑制细菌的生长繁殖，应该用0.5~1.0M的NaOH冲洗PS-DVB生产的整体柱，这种柱子应该在室温条件下暴露在NaOH溶液中至少一个小时。当以传统的聚合物为填充材料的色谱柱被用于分离一些难以处理的蛋白质，如膜蛋白，结构蛋白和病毒包衣蛋白时，就需要很强的冲洗条件，因为这些蛋白质很难溶解，比如为了清除这些蛋白质，可能需要含3M盐酸胍的50%异丙醇和60℃的条件。The cleavage of synthetic peptidesfrom solid-phase resins generates reactive carbonium ions that are scavenged byanisole and thioanisole. The scavenger-carbonium reactions yield large,aromatic molecules that can foul reversed-phase columns during peptidepurification.这些污染物在C18上的保留能力很强，不能被100%乙腈或甲醇清除掉，为了清除这些物质，分别用3~5个柱体积的100%异丙醇，3~5个柱体积的二氯甲烷，用3~5个柱体积的异丙醇，最后是初始的溶剂系统来冲洗色谱柱，将UV的波长设置为260nm就可以检测到这些被冲出来的芳香杂质。以氧化锆为基质的HPLC色谱柱的再生
ZirChrom Separations, Inc. (Anoka, Minnesota,USA) 已经生产了一系列以氧化锆为基质的色谱柱，他们的产品线中有几种反相色谱柱，包括polybutadiene, polystyrene和graphitizedcarbon version.氧化锆的PH稳定性比硅胶更好，因此，包衣氧化锆更稳定也能耐受更极端的使用条件，比如更高的PH和更高的使用温度等。然而，正是由于其特殊的表面性质，实验员应该维持特定的试验条件以便在多种分析中都能够成功地使用色谱柱。羧酸、氟化物和磷酸盐都会强烈地吸附在氧化锆色谱柱上，为了将它们清除掉，可以用以下方法来冲洗色谱柱，先用50个柱体积的20%乙腈与0.1M HNO
3或0.1M氢氧化四甲基铵的混合溶液，再用10个柱体积的纯化水，最后用20个柱体积的100%有机溶剂。对于polybutadiene和polystyrene色谱柱，甲醇，乙腈，异丙醇和四氢呋喃都是可以使用的，而对于石墨柱，流动相中至少需要20%的四氢呋喃。总结
反相色谱柱在反复进样品基质中含有强保留性物质的样品时就会被污染，这些物质具有很高的分子量或为天然疏水化合物或生物活性物质比如蛋白质时尤为如此，因为这些物质会牢牢地吸附在硅胶上。另外，特定的添加剂如离子对试剂和表面活性剂也会吸附在填料表面并改变他们的性质。被污染的色谱柱会表现出峰形不好，保留时间重复性差，柱压升高和基线波动等异常现象。通常使用能够使污染物与键合相或硅胶之间相互作用断开的有机溶剂和试剂来清洗色谱柱。在清洗与再生色谱柱的过程中，色谱工作者也应该小心，因为作用太强的试剂也会对键合相本身造成损伤。此外，也应该养成良好的实验习惯以避免色谱柱污染，良好的样品前处理就可以将色谱柱暴露在未知物质中的风险降到最低。在所有应用中，我都强烈建议使用保护柱以避免污染和其他可能存在的对色谱造成损伤的风险。
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