主题：【分享】基因重组中的关键反应和机制讲解【图文并茂版】

基因重组技术是想从事生命科学领域的同学不可不懂的关键技术之一，本文以图文并茂的形式展示了基因重组中的限制酶、载体、分子克隆、基因表达以及基因文库中的重要反应和机制。

重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。

重组DNA技术(Recombinant DNA Technique)是人类根据需要选择目的基因(DNA片段)在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。

这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。

一、限制酶

限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶(“分子手术刀”)。 发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。

1.  限制酶的命名

根据其来源命名。如：

EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。

2.  限制酶识别序列和切割形成

每种限制酶能识别和切割的通常4～8个核苷酸序列，称为限制性位点或切点。

部分常用限制酶及切点

互补末端连接

产生相同序列的突出末端的不同片段 可有三种方式：

（1）用同一种限制酶切割;

（2）用识别相同靶序列的不同限制酶切割;

（3）用识别不同靶序列但可产生一致的粘性末端的限制酶切割。

3.  特点

根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途：

（1）不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等。

（2）用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点。

（3）Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。

二、基因运载体及其选择

载体(Vector):将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。

载体具以下特征：

（1）分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主细胞并在其中增殖;

（2）有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点;

（3）被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因(如，抗药基因)。

常用的载体有：质粒，λ噬菌体，粘粒，BAC，YAC，PI等。

质粒plasmid

Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。

常用的质粒如pUC19，多连接子MCS。插入外源基因片段长度约10kb。将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。外源基因插入到MCS后，β-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源基因，则产生兰色。从而筛选阳性菌落。

噬菌体

是一种可在体外包装的细菌病毒,可高效感染大肠杆菌，噬菌体DNA是线状双链DNA分子,全长约50kb,每条链各带12 bp长的单链互补末端-粘末端(COS序列)。进入宿主细胞后不久，COS序列碱基配对环化。

改建后的噬菌体发展了多种较大型的克隆载体，如：

1.  置换载体 – 溶解途径

载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。可克隆23 kb的外源DNA。

2.  插入载体 – 裂解途径

DNA在宿主细胞中复制，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可克隆5 kb的cDNA。

裂解途径

粘粒(cosmid vector)(30～40 kb)

是将质粒和噬菌体改建的一种载体.它含COS序列,插入一小plasmid –而得名Cosmid。改建后的粘粒含有噬菌体的复制起点和cos 末端。全长8 kb。大片段外源DNA插入后，在体外包装进而被克隆。可包装30～45 kb长的DNA片段，多用于基因文库构建。

大片段DNA克隆载体

人类和哺乳动物的基因组很大，甚至许多单个基因也相当大(如：DMD gene 2300 kb) ，克隆分析就需要更大的基因载体。如近年来构建的一些载体：BAC，PI，YAC等。

1.  细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)

优点：能携带大片段DNA，约300 kb。 在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高产DNA。

缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克隆DNA部分的缺失或重排。为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，如，E coli中的F因子。此质粒含有2种基因(part A, part B)。每个E coli能接受 >300 kbDNA片段。

2.  噬菌体PI载体和PAC

PI噬菌体与噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含相当大的(110～115 kb)线性DNA，并在体外包装于PI壳内。PI进入宿主细胞后环化，扩增。

1994年，有人将PI和F因子克隆结合产生PI人工染色体克隆系统-----PAC。

3.  酵母人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC)

YAC 的主要功能成份有三：

（1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。

（2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。

（3）自主复制序列(ARS)元件：是染色体自主复制的复制起点。

构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。

三、DNA重组与分子克隆化

为获得所需的基因或特异序列，需从细胞中分离得到目的基因与载体DNA重组，并用适当方法在宿主细胞中表达，扩增得到大量相同的DNA片段，称为DNA克隆，亦称分子克隆。