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主题：【求助】高效液相法PITC柱前衍生检测蛋氨酸

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a6712947
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发表于：2014/02/09 09:39:41 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
前处理：标准溶液  称取D-蛋氨酸标准品（阿拉丁，纯度99%）30mg于100ml容量瓶中，加入0.1mol/ml 盐酸溶液溶解并定容。取上述溶液5mL，置于25ml量瓶中，加入0.1mol/L PITC-乙腈溶液及1mol/mL三乙胺-乙腈溶液各2.5mL，混匀。取溶液10mL，加入正己烷15ml，放置20min，取下层溶液，微孔滤膜（0.45um）过滤，即得。

                空白溶液： 取0.1mol/ml 盐酸溶液5mL，置于25ml量瓶中，加入0.1mol/L PITC-乙腈溶液及1mol/mL三乙胺-乙腈溶液各2.5mL，混匀。取溶液10mL，加入正己烷15ml，放置20min，取下层溶液，微孔滤膜（0.45um）过滤，即得。

仪器：岛津LC-15C,紫外检测器SPD-15C

色谱条件：色谱柱：PhenomenexSynergiC18柱(4.6 mm×250 mm,4μm)

                        流动相：0.1mol/L乙酸钠溶液（乙酸调PH=6.5）+乙腈=80+20

                        检测波长：254nm

                        柱温：43°C

                        流速：1.0ml/min

                        进样量：20ul

色谱图如下

                    备注：黑色为空白溶液。

                            红色为蛋氨酸标准溶液。



问题：1、杂峰太多太大，有什么更好的除杂办法？

          2、D-蛋氨酸怎么是两个峰？

          3、大家有什么有更好的条件柱前衍生法测定蛋氨酸？（目前用柱前衍生测定蛋氨酸，可以后，测定多中氨基酸）

备注：PITC-乙腈溶液放置了1个月，不知道有没问题。



希望大家不吝赐教！感激不尽！



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a6712947
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2014/2/9 21:27:50 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
自己重新配置 PITC-乙腈溶液，做出来D-蛋氨酸就是一个峰，看来是PITC-乙腈溶液放置时间过长变性导致变成两个峰了。
该帖子作者被版主 zhaohua8011加 2积分， 2经验，加分理由：鼓励分享
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zhaohua8011
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2014/2/10 12:54:15 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 a6712947(a6712947) 发表:
自己重新配置 PITC-乙腈溶液，做出来D-蛋氨酸就是一个峰，看来是PITC-乙腈溶液放置时间过长变性导致变成两个峰了。


流动相还是不要配置太多，长时间放置！
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a6712947
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2014/2/11 9:17:54 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
这个到是没有。
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老多_小多
emoc98311
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2014/2/11 11:33:42 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
图谱怎么看不到
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doczheng
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2014/2/12 9:03:38 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
如果你想以后做多种氨基酸，建议你还是从梯度入手吧，18种氨基酸也是这样分出来的，还有一个建议,衍生化反应的时候，把体积缩小比例，衍生时控温和控时
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有水有渝
xky0230699
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2014/2/12 14:39:27 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
PITC衍生以前做过好像要加热衍生，楼主给的方法中衍生不需要时间吗？
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zjxhigh258
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2014/2/13 16:00:03 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
楼主你好!
我也用PITC柱前衍生测过色氨酸和络氨酸（其实这两种用210紫外即可，带环的），衍生方法基本与你相同，上样后也是一对杂峰。自己当时回想一下，可能0.45过滤有影响，会不会是混合液中的有机相把滤膜溶解了产生杂质？我当时用的是水系的针式滤膜，所以用有机系膜会不会消除影响？ 需验证。在文献上看PITC衍生是现在的主流方法呢，应该不会有问题。
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a6712947
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2014/2/16 15:37:50 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 有水有渝(xky0230699) 发表:

PITC衍生以前做过好像要加热衍生，楼主给的方法中衍生不需要时间吗？


需要，是我没写清楚，衍生1h
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2014/2/16 15:41:05 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 doczheng(doczheng) 发表:

如果你想以后做多种氨基酸，建议你还是从梯度入手吧，18种氨基酸也是这样分出来的，还有一个建议,衍生化反应的时候，把体积缩小比例，衍生时控温和控时


是按比例，缩小试剂的用量吗？

我看到有一些资料上，氨基酸200ul，PITC100ul，正己烷400ul。

这样做的，好处是什么？量小，衍生更彻底吗？
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a6712947
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2014/2/16 15:42:17 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 zjxhigh258(zjxhigh258) 发表:
楼主你好!

我也用PITC柱前衍生测过色氨酸和络氨酸（其实这两种用210紫外即可，带环的），衍生方法基本与你相同，上样后也是一对杂峰。自己当时回想一下，可能0.45过滤有影响，会不会是混合液中的有机相把滤膜溶解了产生杂质？我当时用的是水系的针式滤膜，所以用有机系膜会不会消除影响？ 需验证。在文献上看PITC衍生是现在的主流方法呢，应该不会有问题。


我做实验的时候，过滤是用的有机膜
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