主题：ZT 生物芯片的构建和阅读

操作

　　打印的第一步是将显微镜载载玻片以统一的形式排列在工作平台上，用在激光平台上的1孔作为引导，然后按下。膜微量滴定

板固定器突然定位在平台的某一位置，用同样的孔来排列自己。同样的微量滴定板固定器保持在冲洗状态，也能被放置在任何方

便的位置。使用者可任意选择保留的配置或进入配置中的参数。缓慢移动模式用于校验，使坐标位置正确。最后，使用者提示增

加微量滴定板，机械手进入自动点样操作。点样笔从微量滴定板中收集样品并点样，从而对每块载玻片进行同样的操作。然后冲

洗/干燥操作，再对新的样品进行重复操直到当所有的样品全部完成。在点样的过程中，程序自动地将同一来源的微量滴定板保留

在磁盘上，优化每一点以及载玻片上的X-Y终点位置。这个文件稍后与基因说明文件合并，产生载玻片上已印好的点的复合说明。

　　观察

　　点大小的精确性依赖着笔尖的规格。尖端精细的槽口要求特殊的微加工工具就象Wire EDM。我们用的笔尖是TeleChem的，与

我们的笔轴相匹配。它们的性能是可接受的，虽然它们是十分脆的。我们希望能获得有进展，更耐用的样式。

　　扫描仪特点

　　我们设计和制造的激光扫描仪IRIS，是Standford大学和国家健康研究所研制的器械的衍生产品，使灵敏度和动态范围最大化

。我们也试图将运转的适应程度结合到设计中，因此在将来能够进行改进，允许更有效的荧光染料的测定（最近引进了DNA自动

测序仪）。两个有染料标记的目标杂交后，玻片被扫描后产生16位TIF图象。每点的象素强度是与染料分子的数量以及与PCR产物

斑点杂交探针数量成比例。

　　设计特点

　　激光扫描仪有一些关键的组成。软件是与HPVEE绘图程序语言同步的程序。规划图形的运动，控制A/D转换数据的捕获，处理

两个频道的信号，显示每一次扫描的真实的时间参数，产生TIF文件的标题以及保存TIF图象的结果。八个样本引进的数据平均为

每一个象素，转换为二进制整数，为校正图象的变化，轮流进行的扫描，然后保存。使用者可以看见大屏幕的示波境波形就是每

次扫描的平均值，最小值和最大值统计。

　　操作

　　自动化分级操作搜索扫描模式，在X轴的方向上连续地通过显微镜载玻片，然后在Y轴的方向上移动一个象素的位置，产生一

个bi-方向的光栅模式。X轴的信号解码器是由特殊设计的触发回路处理的，取消了每次扫描后的随动震动，产生了在所有方向上的

A/D转换的清晰触发。回路保证了微米以下的空间分辨率和图象的线性结构。两条激光光柱合成联合直线，通过双重光束分割滤波

器反射过目标，形成刺激显微镜载玻片上染料分子发荧光的精细聚焦光束。部分荧光是由目标分子捕获的，通过双光分裂滤波器

发送，在滤波立方中分成红绿两种信号，在波段通过器中过滤。发送入各自的转换电信号的光电管（PMT0）中。每个光电管被

A/D转换器放大，过滤和采样。转换器完成8个附加抽样，软件达到平均每象素8个样本，产生真实的16位分辨率的图象。

　　观察

　　我们最初获得了不恰当的信噪比，因此制定了双成分过滤器，（根据浓度）建立了我们规格，降低DC成分的干扰水平。立体

过滤成分的去除，进一步改进了灵敏度。我们原先的设计有包括两个相配的聚焦镜的立体过滤器，小孔和不同的元件，这些如果

组合在一起形成了共焦显微镜。但是我们发现光学共焦不能加强检测。事实上，镜头使干扰水平增加了两倍，这是由于自动的荧

光性-整个装备导致了所需信号相当大的衰减，结果所有信噪比大大地减弱。我们因此推断在X轴方向的立体过滤在应用中没有起

到作用。我们发现激光输出的清晰过滤对降低干扰是基本的。最后，为了达到可视成分的精细排列和精确的最佳聚焦，利用了刻

度载玻片和软件，获得了高灵敏度的双物镜系统和广大的动态视野范围。

　　有时遇到的问题是镜子干扰的存在，由十分明亮但比我们所需的点的图象要小（<1μm-25μm）的信号组成。我们认为这是由

于灰尘和没结合的染料所形成的。在干净的环境中操作，严格遵守杂交程序对减少这些影响是十分必要的。

　　在屏幕上显示的波形是可重复的。当比较同一行的重复扫描，我们发现极好的重复性。从中我们降低了由于扫描仪的光学和

电子学因素而没传入的有用信号所产生的变形。当调节不同的控制参数时，这个显示能力也使我们精确地测量了在信号-干扰率上

的影响。PMT冷却是包括在保持电子干扰最小化的设计中的。迄今为止，当PMT冷却到-18℃时，我们还没有找到在提高灵敏度方

面的巨大进展。系统的干扰水平还没有达到电子干扰的水平，它的重要元件仍旧有光学干扰。可能是杂交进程中在载玻片上留下

了一些自动显示荧光的残余。我们正开发新的方法来进一步减少干扰水平。

　　从目前系统的灵敏性来看，10 mW激光的能量看来是足够的，5mW就能产生令人满意的结果，并且显示了在这个区域中系统

的增进是直线的。PMT的电压和激光能量是可交换的，不需要降低信号-干扰率。

性能

　　比较扫描仪的性能，通常没有可接受的标准。为了测定我们扫描仪的性能，通过利用一些包含不同浓度Cye3染料校准的载玻

片来测定灵敏性。结果显示扫描仪能可靠地测定在100μm点上少于10-18 摩尔的染料的浓度。我们试图实现对染料结合和杂交能力

测定的附加实验，但是性能显示我们用目前的探针预备方法能探测到低量的mRNA。初步的结果显示我们的扫描仪有比市场上的扫

描仪高四倍的灵敏度，同时能处理多三倍的信号（在饱和状态前）。我们的扫描仪有超过1000倍的动态范围，明显比高密度过滤

器的10倍的动态范围要好。我们能同时进行双色成像，但是是有限制的，因为有两个通道之间的干扰。这能通过在一个时间扫描

一种颜色的方法而最小化，虽然当每块载玻片用两种以上的染料时，交叉激发仍能产生干扰现象。由我们的系统产生的典型的芯

片，扫描用典型的12.8μm的象素大小，能产生16位分辨率的2048 by 1550象素的图象。每个点覆盖了大约100个象素，成像的扫

描时间大约是40分钟。

　　杂交注意事项

　　DNA的数量。芯片上每点DNA的数量是可估计的。猜想每点堆积的形状是半球形的，它的容量是可以计算的：

一点的量=1/2 × (4/3πr3 )

每点的DNA的数量=样本的浓度 × 每点的量

　　斑点的容量少意味着用于杂交的探针的数量也很少，即使样本的浓度很高。必须努力减少这样的限制。一些因素必须考虑到

，除了探针DNA的数量外，还有与目标分子相互补的探针DNA的比例，长短，目标分子的活性，就象用于检测信号方法的灵敏度

影响着信号的强度。

　　杂交信号的浓度是与目标分子活性成比例的，与它的长度成反比，因此目标分子的特殊活性是十分重要的。每次实验的杂交

时间也应该精确测量。

　　沉积机制

　　点样笔的精确切口允许利用毛细现象从微量滴定板中吸取样本。压力由点样笔向下的运动产生，载玻片的表面张力拖动样本

从切口内到玻片上。点的大小依赖于点样笔向下及离开载玻片的加速度和载玻片表面的张力。点样笔向玻片的加速度与点的大小

成比例，因此能调整到所希望的点的大小。当点样笔从玻片收回后，在切口内的样品和沉积在载玻片上的样本之间的流量就形成

了。如果收回的速度很快尖端的量就被打断了，产生了大的点，不是完美的半球形。如果收回的速度十分慢，点样量就在尖端"修

剪"了，留下的点就小。

　　DNA样本

　　样本准备在96孔的板上，乙醇沉淀并用70%的乙醇洗涤,然后在2×柠檬酸钠（SSC）中重建。样本浓度的重建依赖于所需点的

大小和样本的粘稠度。如果样本需要排列为小的点，它们的浓度就要高。但是，限制因素是笔尖的设计，会使样本粘稠而难以排

列，那些浓度大于2μg/μl的太粘了而不能点样。我们点样的目标浓度是每个样本15ng一个点。虽然我们在2SSC中重新建立了样本

，但是溶液的离子浓度能在1×SSC到5×SSC之间而不影响杂交，然而样本溶解在溶液中后离子浓度高于5×SSC就很难与载玻片接

触。

　　将DNA固定到玻璃片

　　在DNA排列到玻片上以后，它们是自然干燥的。样本的固定是通过紫外线（UV）固定的，形成在DNA上的胸腺嘧啶脱氧核苷

残基和硅烷玻片上氨基之间的共价键。类似的方法也用于将DNA样本固定在尼龙膜上。为了完成最大化的杂交，要在紫外线交联

之前，芯片要保持微量的湿润，通过将"排列"暴露在沸水中，然后在254nm的紫外线下暴露到0.27J/cm2 。我们发现精密测量照射

的量是十分有利的，只要确定产生最佳信号的照射最佳水平。过长时间的照射导致了由于连接不充分而产生的DNA损失和个别地

，DNA样本的过多的断裂。在交联后，过多的DNA分子在室温下被0.1%的SDS冲洗掉，然后在杂交以前，排列的样本在95℃的水

中变性。

　　杂交中的

　　有许多方法使目标分子和探针进行杂交。我们发现三个工作溶液对于荧光探针和固定在玻璃上的DNA的杂交是很好的；与溶

剂和温度不相关。一般来说，在42℃，甲酰胺基础上的杂交比65℃水溶液中的要好，因为促进了信号和杂质的比率。但在甲酰胺

中的动态杂交要比在水溶液中的慢，当用低拷贝量的目标分子时，建议使用有右旋糖苷硫酸盐或聚乙烯乙二醇的水溶液。

　　类似的方法用于使"杂质"最小化：用Denhardt试剂，十二烷基硫酸钠（SDS）修剪鲑精DNA，tRNA和Cot1DNA。当我们用

cDNA时，也包括多聚A RNA或与富含T的序列相连接的多聚A。

　　讨论

　　我们集体的努力显示了在学术环境下如何实现芯片技术的。在AECOM，芯片和扫描仪是由家庭工程师制造的，使用家庭工程

师的好处是她/他是亲手改良和维修仪器的。在Pennsylvania大学，芯片是在大学机械店的帮助下在实验室中制造的；扫描仪

（General扫描仪公司）是购买的。

　　芯片构建的改良技术必须与基因组克隆图谱实用性的增加，好的cDNA克隆，分析工具的良好使用相匹配。这些工具的综合和

易操作性对基因研究发展的速度是十分重要的。

生物芯片的制作

　　对于一些实验室来说，如果现成的商品化芯片不能满足研究需要，而自行设计向厂家定做芯片也不能满足时间的需要时，就

需要自制芯片。要成功的制作芯片，需要准备3大材料：准备固定在芯片上的生物分子样品、芯片片基和的制作芯片的仪器。研究

目的不同，期望制作的芯片类型不同，制备芯片方法也不尽相同，以DNA芯片为例，基本上可分为两大类：一类是原位合成（即

在支持物表面原位合成寡核苷酸探针），适用于寡核苷酸；一类是预合成后直接点样多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，

甚至mRNA。

　　原位合成有两种途径，一是原位光刻合成（Affymerix公司专利技术，参见前文介绍），该方法的主要优点是可以用很少的步

骤合成极其大量的探针阵列。某一含N个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4×N个化学步骤能合成出4N个可能结构。例如合成想要8核苷

酸探针，通过32个化学步骤，8个小时可合成65，536个探针。而如果用传统方法合成然后点样，那么工作量的巨大将是不可思议

的。同时，用该方法合成的探针阵列密度可高达到106/cm2。

　　另一种原位合成是压电打印法(Piezoelectric printing)。原理与普通的彩色喷墨打印机相似，所用技术也是常规的固相合成方法

。不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基合成试剂。喷印头可在整个芯片上移动。支持物经过包被后，根据芯片

上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。冲洗、去保护、偶联等则同于一般的固相合成技术。该技术采

用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制定备的化学试剂。每步产率可达到99%以上，可以合成出长度为40

到50个碱基的探针。

　　尽管如此，原位合成方法仍然比较复杂，除了在基因芯片研究方面享有盛誉的Affymetrix等公司使用该技术合成探针外，其它

中小型公司大多使用合成点样法。

　　点样法是将预先通过液相化学合成好的探针、或PCR技术扩增cDNA或基因组DNA经纯化、定量分析后，通过由阵列复制器（

arraying and replicating device ARD）或阵列点样机（arrayer）及电脑控制的机器人，准确、快速地将不同探针样品定量点样于带

正电荷的尼龙膜或硅片等相应位置上（支持物应事先进行特定处理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷），再由紫外线

交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。点样的方式分两种，其一为接触式点样，即点样针直接与固相支持物表面接触，将DNA样

品留在固相支持物上；其二为非接触式点样，即喷点，它是以压电原理将DNA样品通过毛细管直接喷至固相支持物表面。打印法

的优点是探针密度高，通常1平方厘米可打印2,500个探针；缺点是定量准确性及重现性不好，打印针易堵塞且使用寿命有限。喷

印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命长；缺点是喷印的斑点大，因此探针密度低，通常只有1平方厘米400点。点样机器

人有一套计算机控制三维移动装置、多个打印/喷印头、一个减震底座，上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片。根据需要还可以

有温度和湿度控制装置、针洗涤装置。打印/喷印针将探针从多孔板取出直接打印或喷印于芯片上。检验点样仪是否优秀的指标包

括点样精度、点样速度、一次点样的芯片容量、样点的均一性、样品是否有交叉污染及设备操作的灵活性、简便性等等。

　　一、点样设备

　Telechem公司全新SpotBot Personal Microarrayer
对于那些需要经常小批量使用多种不同的研究用芯片的普通用户来说，向Affymetrix这样的大公司定做自行设计芯片的时间和成本

太高，然而又不太可能支付得起一套高性能的大型生物芯片点样制作系统，Telechem公司最新推出的SpotBot个人微阵列点样机绝

对是一个好消息。这种只有一台台式普通离心机大小(30cm x 30cm x 22cm)的个人芯片点样机功能相当完备：
　4针的打印头(4-Pin Printhead)可以配各种Stealth点样针；
　一次可以放置14张玻片(25mm x76mm/片)；每张片可以点3600个点(9mm x9mm区域)；
　最大的打印范围可达20mm x 70mm；将来软件升级后每张片将可以打50400个点；
　点样可以选择每个样品单点、双点或者3点；
　可以放置1块384孔板，可以手工换板；
　完成一块384孔板的点样时间为2小时(每个样品3点，14张玻片)，6小时可在14张玻片上点超过1000个样品(双点/样品)；
　先进的自动清洗干燥台保证样品之间没有交叉污染；
　透明罩保证点样工作环境的清洁和恒定的温度和湿度；
　开关门感应器保证用户的安全；
　轴运动偏差±10μm；
　外形轻巧可爱，连真空泵和蠕动泵在内总重仅6.4公斤，
　最令人惊喜的是价格相当便宜！



　　美国Cartesian Technology公司的MicroSys 5100小型台式芯片工作站MicroSys 5100也是专门为实验室做小量芯片研究工作设

计的一套台式工作站。一次处理10张芯片，采用接触式点样技术，使用标准的CHipMaker或Stealth点样针，可放置1块96/384孔样

品板，并配有一套载片真空固定系统和一套针头清洗真空干燥系统。价格低廉，非常适合经费紧缺的研究部门做芯片应用的中小

型研究项目使用。

　　对于中型到大型的用户则可以选择美国Cartesian Technology公司PA系列、SQ系列生物芯片点样制作系统。这家公司在芯片

技术刚出现时就致力于开发能将生物芯片变为现实的点样制作系统，并得到生物芯片技术的开创者M.Schena的支持。通过与著名

的点样针制作厂家TeleChem公司联合，融合自身拥有多项专利的喷点技术，生产的芯片点样系统一直在该领域独占鳌头。

　　PA系列是应用专利的 PinArrayTM （针阵列）技术，在玻片等基质上生产高密度芯片的生物芯片点样系统，该系列的产品均

使用TeleChem公司的 ChipMaker 和 Stealth 系列点样针。点阵密度可以达到2500/cm2

　　PixSys 5500 PA Workstation.

　　适用于中等工作量研究用途的点样工作站。该系列配备精密的Telechem点样针，也可同时选配synQUAD微定量喷头，点样快

速、精确，适用范围广泛，使目前生物芯片点样系统的主流产品。



　　ProSys 5510 PA Workstation.

　　应用其专利的PinArrayTM 技术在玻璃片基上生产高密度芯片的高通量点样工作站。适用范围广，点样快速精确，自动化程度

高，一次可处理100张芯片，适合大规模的工业化生产使用。
SQ系列生物芯片点样系统

　　SQ系列使应用其专利的synQUADTM 技术在各种类型的膜及玻片等基质上进行非接触的同步喷点系统，还可以用来进行转板

等微定量液体转移工作。点样速度可达1000点/分钟。

二、芯片片基

　　用点样法制作芯片，除了专用的仪器外，还需要要选择合适的固相支持物--芯片片基，也就是载体材料。一般来说各种芯片片

基都选择经过相应处理的硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等作为支持物。作原位合成的支持物在聚合反

应前要先使其表面衍生出羟基或氨基（视所要固定的分子为核酸或寡肽而定）并与保护基建立共价连接；作点样用的支持物为使

其表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸等。我们在下面介绍一些常见的相关产品：

　　膜：与玻片相比，膜的优点是与核酸亲和力强，杂交技术成熟，通常无需另外包被。由于尼龙膜与核酸的结合能力、韧性、

强度都比较理想，以膜为基质的芯片绝大多数采用尼龙膜。Schleicher & Schuell 公司是专业生产杂交/过滤膜的公司，著名的硝酸

纤维素膜即是该公司首家推出的。S&S的Nytran SuPer Charge正电荷尼龙膜带电量是常规正电荷尼龙膜的3倍，与核酸的结合力更

强，而且又大大降低了背景和非特异结合，克服背景高的缺点，加上韧性强，反复杂交10次依然保持表面平整的优点，成为制作

尼龙膜芯片的最佳选择。Nytran SuPerCharge有多种规格，详细资料可以向基因有限公司查询。

　　玻片：用于制作芯片的玻片必须特别清洁和平滑。玻片表面必须包被合适的功能基团能将靶DNA片段固定住并防止其在杂交

洗涤过程中被冲洗掉。经表面化学处理的玻片是一种持久的载体，它可耐受高温和高离子强度；玻片具有不浸润性，使杂交体积

降低到最小，因此提高了退火时的动力学参数，疏水表面可以使点密度大于亲水表面（因为亲水表面上样品点将扩散）；玻片的

荧光信号本底低，不会造成很强的背景干扰；玻璃芯片可使用双荧光甚至多荧光杂交系统，可在一个反应中同时对两个以上的样

本进行平行处理。由上可知，以玻璃为载体的芯片更具有发展和应用的前景。

　　S&S公司的CAST Slides(Cat.No.10484181,20/box)将SuPerCharge正电荷尼龙膜附着在玻片上，这种特殊的玻片综合了尼龙膜

的高亲和力和玻片刚性的优点，是世界上第一个膜结合玻片。而FAST Slides (Cat.No.10484182,20/box)则是在玻片表面包被一种

专利的聚合物，这种聚合物能迅速与DNA以非共价但是不可逆的方式结合。由于表面包被层的多孔性和厚度使单位面积的DNA结

合能力比常规化学表面处理玻片要高得多，使得检测更加灵敏。其杂交方式和传统的杂交一样。适用的检测方法包括同位素检测

、化学发光法和荧光检测--由于包被的多聚物有效降低对入射光的散射，FAST Slide同样适合用激光共聚焦成像系统进行荧光检测

。

　　TeleChem ArrayIt Super Microarray Substrates(25mm x 76mm)采用高清洁度，超平表面的的玻片并进行化学修饰，各项技术指

标居同类产品前列。SuperClean(Cat.No.SMC-25, etc.)， SuperAmine (Cat.No.SMM-25,etc.)和SuperAldehyd(Cat.No.SMA-25, etc.)三

种规格可偶联核酸、蛋白、甚至细胞，且偶联过程可以在室温及中性条件下进行。

　　Clontech提供的DNA-Ready Type I Slides (Cat.No.7880-1, 5 slides/box)是氨基修饰的，能结合200bp-10kb的修饰和未经修饰的

DNA，DNA-Ready Type II Slides (Cat.No.7881-1, 5 slides/box)是特殊氨基修饰的，能结合50bp-10kb的修饰和未经修饰的DNA。

　　另外CEL公司也提供醛基化修饰的玻片Silylated Slides(Cat.No.CSS-25)。

三、点样样品

　　点样样品的制备是非常关键的一步。样品的纯度、杂交特异性直接决定自制芯片的质量和可信度。可以说，没有好的样品，

自制芯片也就没有多大意义。

　　我们在前面介绍了Clontech公司的Atlas系列，其中Glass Array和Plastic Array上那8300个基因对应的80碱基长寡核苷酸序列是

经过Clontech公司专利软件在GenBank中筛选出的同源性最低，又经Clontech实验确保能给出很强杂交信号的片断。这种精巧的设

计保证很高的分辨率、灵敏度，实在令人印象深刻。现在，你可以通过基因公司定购这些寡核苷酸来制作自己的芯片了。足够点

1000次芯片的8327个人类基因、5002个小鼠基因或者将近4000个大鼠基因的寡核苷酸片断（冻干）放在96孔板中，连同100个

Type II玻片和杂交盒，200ml杂交液，全面满足中小型实验项目的需求。这些寡核苷酸序列数目齐全，质量可靠，能为自制芯片的

灵敏度和分辨率提供可靠的保证，也避免了合成8000多基因的麻烦。还有更大包装可供选择。对Atlas Nylon Array上的200-600bp

的cDNA片断感兴趣的研究人员则可以选择Ready-to-Print cDNA 系列，共计5278个人类基因，3197个小鼠基因或者2727个大鼠基

因（每个基因片断有3ug，分装在96孔板中），均可定购。

Cat.No.
Product(基因数目)
可点芯片数

CS2006
Human Long Oligos(8327)
1000

CS2007
Mouse Long Oligo(5002)
1000

CS2008
Rat Long Oligo(4000)
1000

CS2009
Human Ready-to-Print cDNA(5278)
3ug/gene

CS2011
Mouse Ready-to-Print cDNA (3197)
3ug/gene

CS2012
Rat Ready-to-Print cDNA(2727)
3ug/gene

如果人、小鼠和大鼠的这些Oligo还不能满足你的需要，那么可以选择Operon公司的Array-Ready Oligo Sets。刚被QIAGEN公

司收购的Operon公司是世界著名的DNA合成专家，提供包括有酵母基因组、人类基因组、小鼠基因组、疟原虫基因组和肺结核杆

菌基因组的Oligo sets。所有的OligoSets都是按最新的数据而设计的。由于测序速度的提升，更多新数据涌现，Operon公司保证以

后根据新数据设计的Oligos将以升级试剂盒的形式提供。

　　Yeast Genome Oligo Set里提供斯坦福大学酵母基因组数据库（SGD）中6307个酿酒酵母的开放阅读框中挑选的长度为70-

mer单链寡核苷酸和10个对照，所有的序列经过BLAST保证同源性最低，避免非特异杂交。每种Oligo有2000pmol，足够点2000-

6000张片。

　　Alaria Genome Oligo Set则包含整个Plasmodium falciparum疟原虫基因组6231个预测的基因或ORF对应的70-mer寡核苷酸，以

及138个对照，是由加州大学的芯片专家Dr.Joe DeRisi协助设计的。数据来源是Sanger中心和TIGR以及斯坦福大学。

　　Operon公司也提供Human Genome Oligo Set，包含13971个来源于UniGene中的已知基因对应的70-mer寡核苷酸序列（Hs

build 119）和29个对照。（The UniGene database automatically clusters all human Genbank sequences into a non-redundant set of

genes. Similar databases are also available for the rat and mouse genomes. Each cluster in the UniGene database represents one

unique gene. A cluster may contain many sequences, but one representative sequence has been selected based on the longest

region of high-quality sequence data.）

　　Mouse Genome Oligo Set同样包含6868个已知基因对应的70-mer序列，数据来源也是Mouse UniGene Build 83，还有16个对照

。每个Oligo的量也是2000pmol。

　　Tuberculosis Genome Oligo Set包含4295个70-mer Oligo，其中大部分是来源于Sanger中心测序的Mycobacterium tuberculosis

H37RV (lab strain)基因组中预测的3924个基因，另外371个是来源于TIGR（The Institute for Genomic Research）测序的TB strain

CDC-1551中和前者同源性低于97%的预测基因。

　　除了购买现成的核酸，还可以通过自己合成寡核苷酸和PCR扩增模板的方法制备点样样品。由于自己合成Oligo成本太高，只

适于少量特殊样品。最常用的还是PCR扩增。一张芯片上可不只10个8个样本，少则上百多则上千个样本的质粒纯化、PCR以及

PCR产物纯化，加上芯片上的样品量很有限，点样的纯度必须有保证，所以QIAGEN公司的96孔高通量核酸纯化系列是最好的选择

。一次可以纯化96个样品，大大简化了上百个样本纯化的工作量和操作强度。

　　26171 R.E.A.L. Prep 96 Plasmid Kit(4x96)——高通量碱法纯化小量质粒DNA，只需60-75分钟即可纯化96个样品，需要96孔板

离心机。

　　27191 QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit(4x96)——高通量碱法纯化小量质粒DNA，采用真空抽滤的方法，只需45分钟即可纯化96

个样品，无需96孔板离心机。质粒纯度高。
27781 QIAprep 96 M13 Kit(4x96——高通量纯化M13单链DNA，采用真空抽滤的方法，只需45分钟即可纯化96个样品。

　　28181 QIAquick 96 PCR Purification Kit--采用真空抽滤的方法，利用硅胶膜技术25分钟内从PCR反应体系中回收高纯度的DNA

，回收率高达90%(100bp-10kb)，可除掉 99.5 %的引物，无需另外去除石蜡油，无需乙醇沉淀，无需酚、氯仿等有机试剂。纯化

产物可直接用于芯片点样或测序。

　　Telechem 公司：世界著名的芯片供应商，提供各种芯片方面的耗材和试剂。其PCR产物纯化试剂盒利用高级滤膜技术，具有

价格低、通量高、速度快等优点。无需乙醇沉淀，无需酚、氯仿等有机试剂。90%以上的回收率，99.9%的DNA纯度，孔与孔之间

的交叉污染小于0.01%，每天可以纯化1000个以上的样品。

Telechem PCR Purification Kits

384-Well PCR Purification Kit

PCR-384-01
Starter Kit (1 x 384)
￥1,320

PCR-384-10
Mini Kit (10 x 384)
￥10,648

PCR-384-50
Midi Kit (50 x 384)
￥48,246

PCR-384-100
Maxi Kit (100 x 384)
￥85,140

96-Well PCR Purification Kit For 25ul PCR Reactions

PCR-25-01
Starter Kit (1 x 96)
￥979

PCR-25-10
Mini Kit (10 x 96)
￥7,084

PCR-25-50
Midi Kit (50 x 96)
￥28,369

PCR-25-100
Maxi Kit (100 x 96)
￥53,218

96-Well PCR Purification Kit for 100ul PCR Reactions

PCR-101
Starter Kit (1 x 96)
￥1,122

PCR-110
Mini Kit (10 x 96)
￥7,788

PCR-150
Midi Kit (50 x 96)
￥31,911

PCR-100
Maxi Kit (100 x 96)
￥56,694

大规模样品纯化

　　对于较大规模制作芯片的用户，由于点样样品数目太多，即使采用这种高通量试剂盒还是不够方便。这时不妨考虑分子生物

学的标准工作站--全自动核酸和蛋白纯化工作站。这可不同于那种单一样品大量纯化的系统，而是特别适合芯片制作的很多个样品

小量纯化系统。

　　随着人类基因组、功能组的研究不断深入，生物芯片的研究在全世界开展的如火如荼，它已经成为进行大规模分子生物学研

究的有利工具。但是在芯片飞速发展的今天，样品制备已经成为芯片发展的瓶颈所在。生物样品往往是各种组分的混合体，成分

非常复杂，传统的核酸和蛋白纯化方法需要花费大量的人力、物力、财力，而且许多有机试剂会对人体造成不同的伤害。如今，

您再也不用为纷繁复杂的纯化过程而烦恼了，世界上声誉卓著的核酸纯化供应商--QIAGEN公司推出了全自动核酸和蛋白纯化工作

站--4个不同的自动纯化系统型号：BioRobot 8000，BioRobot 3000，BioRobot 9604，BioRobot 9600，加上QIAGEN优质的多种配

套纯化试剂盒--从质粒、粘粒、RNA、血液基因组DNA、病毒DNA到蛋白，品种丰富，信誉卓著，带着德国人的严谨和自信，在欧

美的生物医学市场上掀起了一场革命，各大分子生物学中心、芯片中心、医学中心争相抢购。作为国内最大的生命科学领域内的

仪器和试剂供应商，我们有理由，更有责任将这套系统推荐给在生命科学领域内忘我工作的科学家，为大家分忧解难，为促进中

国的生物芯片产业发展尽牵线搭桥，为缩小与欧美在生命科学领域内的差距尽一份薄力。

　　BioRobot 8000:

　　专为基因组实验室设计，同时也可以用于其他分子生物学领域。高通量、快速、全自动核酸纯化系统，功能强大的真空过柱

、振荡混匀及加热制冷装置，无需离心即可进行核酸纯化。8通道自动移液系统可以对384孔板进行准确、快速地移液处理。

　　特点：

　　1、高通量核酸纯化。
　　2、速度快、全自动样品传送及液面监控。
　　3、高精确处理384孔板。
　　4、提供优质配套试剂，结果重复性好。
　　5、具有功能强大的软件处理系统。
　　6、提供配套的优质试剂

　　BioRobot 3000:

　　此系列为可根据客户的不同需求量身定做的分子生物学平台。自动移液，软件功能强大，用途广泛。主要可以应用于：基因

组或质粒DNA，RNA纯化病毒DNA，RNA纯化，6×His蛋白纯化，PCR产物纯化，PCR、测序及其它反应体系准备，Re-arraying。

　　特点：

　　1、根据客户的不同需求量身定做
　　2、灵活的操作系统、满意的结果
　　3、准确的枪头定位系统（根据液面不同）和液体传输系统
　　4、可选择与其他仪器（如分光光度计）连用的自动机械臂
　　5、自动的样品跟踪和过程控制系统（条形码扫描）
　　6、简单易学的软件操作系统
　　7、提供配套的优质试剂
　
　　BioRobot 9604；



　　此仪器是专为临床样品和细胞培养液设计的核酸自动纯化的分子生物学工作站。可自动从临床诊断样品（各种血样，体液，

口腔刮离细胞及细胞培养物等）中纯化基因组DNA、质粒DNA、RNA、病毒DNA及RNA，还可进行PCR产物纯化，PCR样品准备。

适用于 医院，检验科分子诊断，血库，检疫，海关病毒检测，血液分型，法医DNA指纹鉴定制药公司药物筛选等。

　　特点：

　　满足分子诊断所需DNA的标准的、自动纯化操作过程
　　满意的得率和可信的结果
　　自动的样品跟踪和过程控制系统（条形码扫描）
　　可同时进行2X96样品，且有很好的可重复性
　　可安全处理有传染性的样品
　　配套的高质量试剂
　　简单易学的软件操作系统
　
　　BioRobot9600：

　　此仪器是为常规分子生物学研究设计的核酸纯化工作站。可以进行质粒DNA，RNA纯化病毒DNA，RNA纯化， PCR产物纯化

，PCR、测序及其它反应体系准备，Re-arraying。

　　特点：

　　 分子生物学标准的、自动核酸纯化操作过程
　　移液过程中不会造成交叉污染
　　配套的高质量试剂
　　简单易学的软件操作系统

杂交

　　互补杂交要根据探针的类型、长度以及研究目的来选择优化杂交条件。如用于基因表达检测，杂交时需要高盐浓度、样品浓度高、低温和长时间(往往要求过夜)，但严谨性要求则比较低，这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度；若用于突变检测，要鉴别出单碱基错配，需要故需要在短时间内(几小时)、低盐、高温条件下高严谨性杂交。多态性分析或者基因测序时，每个核苷酸或突变位都必须检测出来，通常设计出一套四种寡聚核酸，在靶序列上跨越每个位点，只在中央位点碱基有所不同，根据每套探针在某一特点位点的杂交严谨程度，即可测定出该碱基的种类。
　　
　　杂交反应还必须考虑杂交反应体系中盐浓度、探针GC含量和所带电荷、探针与芯片之间连接臂的长度及种类、检测基因的二级结构的影响。有资料显示探针和芯片之间适当长度的连接臂可使杂交效率提高150倍。连接臂上任何正或负电荷都将减少杂交效率。由于探针和检测基因均带负电荷，因此影响他们之间的杂交结合，为此德国癌症研究院的Jorg Hoheisel等提出用不带电荷的肽核酸（PNA）做探针效果更好。虽然PNA的制备比较复杂，但与DNA探针比较有许多特点，如不需要盐离子，因此可防止检测基因二级结构的形成及自身复性。由于PNA-DNA结合更加稳定和特异，因此更有利于单碱基错配基因的检测。我们在这里简单介绍一些常用杂交试剂和消耗品

　　对于商品化的芯片和Array类产品，通常都有配套的杂交试剂以方便使用。例如：

　　1. Clontech公司的Altas Glass Microarrays，产品已经包含GlassHyb? Hybridization Solution和GlassHyb? Wash Solution，能有效缩短杂交时间，提高信噪比。同时还提供了方便使用的Altas Glass Hybridization Chamber，旋盖式的设计和1.8ml的容积，避免了传统coverslip式杂交盒的弊端。可以单独购买。

7899-1 Altas Glass Hybridization Chamber each
8016-1 GlassHyb? Hybridization Solution 50ml

　　2. Clontech ExpressHyb Hybridization Solution快速杂交液能有效加快杂交速度，减少杂交时间，同时提高灵敏度。适用于各种基于膜的核酸杂交反应，如cDNA Array、Southern、Northern、菌落原位杂交，特别是Clontech公司的Altas系列、MTN系列、MTE系列的各种膜基质的Macroarray。在 这些系列的产品中均配有快速杂交液样品。由于膜可以反复使用，通常需要另外购买快速杂交液。

8015-1 ExpressHyb Hybridization Solution 250ml
8015-2 ExpressHyb Hybridization Solution 500ml

　　3. 对于自己制作的芯片，可以自行配置杂交缓冲液，也可以参考Ambion公司提供的几种Glass Array 杂交缓冲液。SlideHyb? Glass Array Hybridization Survey Kit是专为玻片或者尼龙膜基质的玻片DNA Array优化杂交条件而设计的。由于芯片的杂交条件受多种因素的影响，Ambion认为很难找到一种适用于所有芯片的杂交缓冲液。在这个试剂盒中提供了4种严谨程度不同的杂交液，供不同的需要。1号缓冲液的杂交条件是最严谨的，背景最低，2、3号的灵敏度相应提高而背景也相应升高，4号缓冲液没有去垢剂。这些杂交液可以单独购买，连预先配好的SDS、SSC等常用缓冲液都可以在Ambion买到。毕竟在芯片这样精密的实验中，在这么小的一个点上的DNA的量是非常有限的，要得到理想的结果需要非常精确的反应条件。Ambion 同样提供芯片杂交盒，抗化学腐蚀，耐70度高温，一次可放三张片。

Cat.No. Product Name Size

1860 SlideHyb?GlassArray Hybridization Survey Kit 100rxns
8861 SlideHyb? Glass Array Hybridization Buffer#1 5 x 2 ml
8862 SlideHyb? Glass Array Hybridization Buffer #2 5 x 2 ml
8863 SlideHyb? Glass Array Hybridization Buffer #3 5 x 2 ml
8864 SlideHyb? Glass Array Hybridization Buffer #4 5 x 2 ml
10040 Glass Array Hybridization Cassette 1 each

4. Ambion同样提供适用于各种核酸膜杂交的杂交液和Wash Buffer，精心优化的反应条件有效提高杂交灵敏度和降低背景，已经经过ULTRArray? (Ambion), Atlas?(Clontech)，LifeGrid? (Incyte Genomics), GeneFilter? (Research Genetics), and Panorama? (Sigma-Genosys) arrays等产品验证。

Cat# ProductName Size
7118 Yeast RNA 10 x 10 mg/ml
8665 ULTRArray? Hybridization Buffer 225 ml
8666 ULTRArray? Hybridization Buffer 500 ml
8667 ULTRArray? Low Stringency Wash Buffer 1 L
8668 ULTRArray? High Stringency Wash Buffer 1 L
9680 Salmon Sperm DNA (sheared) 10x10 mg/ml
9763 20X SSC 1 L
9765 20X SSC 4 x 1 L
9780 RNaseZap? 250 ml

图象的采集和分析

　　当生物芯片和样品探针杂交完毕后，就需要对杂交结果进行图象采集和分析。一般膜芯片的杂交都用同位素p32、p33作标记，其信号的检测需通过传统的磷光成像系统来完成。而对于用荧光标记的玻璃芯片杂交后的检测，则需要用专门的荧光芯片扫描仪。

　　1. 磷感屏成像系统Cyclone Storage Phosphor System

　　Cyclone磷屏成像系统为美国Packard公司生产的第一台集高分辨率、高灵敏度和5个数量级的线性范围于一身的计算机控制数字化自动放射成像分析系统，由于其使用方便、快捷、自动化程度、分辨率、图像清晰度均很高，既可定位亦可定量，目前已广泛应用于核医药学、细胞与分子生物学、生物化学、药理学、基因工程学、药物代谢动力学、放射免疫及受体免疫等多方面实验研究，成为十分方便的有力工具。其优异品质主要得益于Packard专利的激光技术和共聚焦成像系统。应用范围为我们前面介绍的DNA Macroarray以及Northern、Southern、Western Blot.，手工测序，放射性原位杂交等的同位素结果检测。使用Cyclon磷屏可以大大缩短研究周期，获得清晰的分辨率。

　　其工作原理在于：同位素标记的杂交结果在磷屏上曝光，曝光过程32P等核素核衰变同时发射β射线，首先激发磷屏上分子，使磷屏吸收能量分子发生氧化反应，以高能氧化态形式储存在磷屏分子中。激光扫描磷屏，对于激发态高能氧化态磷屏分子发生还原反应，即从激发态回到基态时多余的能量以光子形式释放，从而在PMT捕获进行光电转换，磷屏分子回到还原态。计算机接受电信号，经处理形成屏幕图像，并进一步分析和定量。一般化学发光物质如荧光染料标记样品成像过程与放射性类似。

　　系统特点

　放射性自显影成像系统。储存式磷屏根据不同样品厚度、射线能量有多种型号磷屏可供选择，磷屏可以多次重复使用。
　灵敏度较X光片高数十倍，可以检测最弱的信号。曝光时间可以缩短20倍以上。
　快速成像，从对磷屏进行扫描到获得完整的的数字化图像，总共需要不到10min的时间，实时图像显示，同时立即报告分析结果。
　可对放射性位置和强度进行相关的定位、定量分析，宽达105的线性范围，定量准确。
　不需胶片、暗室设备、冲洗底片，一步到位完成分析过程。
　可选配Ouant ArrayTM 软件，用于尼龙膜上同位素标计的Gene Array定量分析。

　　2. 荧光芯片扫描仪

　　由于杂交时产生序列重叠，会有成百上千的杂交点出现在图谱上，形成极为复杂的杂交图谱。序列重叠虽然可为每个碱基的正确读出提供足够的信息，可提高序列分析的可靠性，但同时信息处理量也大大增加了。一般说来，这些图谱的多态性处理与存储都由专门设计的软件来完成，而不是通过对比进行人工读谱。用计算机处理即可给出目的基因的结构或表达信息。扫描一张10cm2的芯片大概需要2-6分种的时间。目前专用于荧光扫描的扫描仪根据原理不同大致分为两类：一是激光共聚焦显微镜的原理, 是基于PMT（photomultiplier tube，光电倍增管）的检测系统（另文介绍）；另一种是CCD（charge-coupled devices，电荷偶合装置）摄像原理检测光子。CCD一次可成像很大面积的区域，而以PMT为基础的荧光扫描仪则是以单束固定波长的激光来扫描，因此或者需要激光头，或者需要目的芯片的机械运动来使激光扫到整个面积，这样就需要耗费较多的时间来扫描；但是CCD有其缺点：目前性能最优越的CCD数字相机的成像面积只有16×12mm（像素为10μm），因此要达到整个芯片的面积20×60mm的话，需要数个数码相机同时工作，或者也可以以降低分辨率为代价来获得扫描精度不是很高的图像。由于灵敏度和分辩率较低，比较适合临床诊断用。

　　生产商业化扫描仪的公司包括：Genomic Solutions公司、Packard公司、GSI公司、Molecular Dynamics、Genetic Microsystems公司、Axon ?Instruments公司等。其中GSI Lumonics 公司ScanArray 系列一直是生物芯片扫描检测系统中的领头产品。2000GSI并入著名的Parkard公司后ScanArray的软、硬件都得到进一步加强。

　 ScanArray利用其专利的激光共聚焦光学系统，通过计算机控制，对生物芯片的荧光杂交信号进行全自动的扫描采集，并通过分析软件对数据结果进行定量分析。

　最高灵敏度高：<0.1荧光分子/μm
　扫描精度可从5μm-50μm分级调整
　全范围扫描时间仅需5分钟，快速方便
　多达十种检测滤光片，涵盖所有生物芯片荧光染料的检测，适用于多种荧光标记探针

　　不同波长依次扫描避免交叉光污染

　　扫描后的图像还需要进一步的处理，这要求一定的软件支持。现有的分析软件包括：Biodiscovery的ImaGene系列，Axon Instruments的GenePix系列，GSI的QuantArray等

3. 基因芯片上各克隆荧光信号的分析原理

　　用激光激发芯片上的样品发射荧光，严格配对的杂交分子，其热力学稳定性较高，荧光强；不完全杂交的双键分子热力学稳定性低，荧光信号弱（不到前者的1/35~1/5），不杂交的无荧光。不同位点信号被激光共焦显微镜，或落射荧光显微镜等检测到，由计算机软件处理分析，得用激光激发芯片上的样品发射荧光，严格配对的杂交分子，其热力学稳定性较高，荧光强；不完全杂交的双键分子热力学稳定性低，荧光信号弱（不到前者的1/35~1/5）（2），不杂交的无荧光。不同位点信号被激光共焦显微镜，或落射荧光显微镜等检测到，由计算机软件处理分析，得到到有关基因图谱。美国GSI ?Lumonics 公司开发出专专业基因芯片检测系统(ScanArray 系列),采用激光共聚焦扫描原理进行荧光信号采集，由计算机处理荧光信号，并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。利用QuantArray软件包对扫描的荧光信号进行分析，比

　　较每个克隆在不同组织间表达水平的差别。软件具体分析步骤如下：

　　首先，同时导入同一区域两个channel扫描的图像文件；将两个channel扫描的图像用不同的颜色显示并重叠；选择拟分析的区域，输入矩阵的行数及列数以及矩阵的个数等参数；在计算机给出的该区域信号图片上标定网格，使得网格中所包含的横线和竖线的交点个数同每个区域点样的克隆数相同，调整网格，使每个交点均位于点样克隆信号的中心；信号的中心确定后，计算机将自动以交点为中心，按照设定的半径圈定各克隆，并将其内部区域作为待分析的信号，同时在圈定的各克隆周围再按照预设的值圈定一定范围的区域，将该区域内的信号作为背景噪音；计算机分析每个克隆扣除背景噪音后的信号强度，并按照不同的要求对数据进行分析；利用GenePie方式对两个channel信号的进行定量比较分析，此时计算机根据各克隆两个channel扫描的信号，以饼图的形式给出两个channel信号强度的相对比例，同时可以逐个克隆读取计算机分析出的两个channel信号的值及所占的比例，进而确定各克隆在两种组织间的表达差异。

　　4. Microarray数据分析

　　Microarray数据分析简单来说就是对Microarray高密度杂交点阵图象处理并从中提取杂交点的荧光强度信号进行定量分析，通过有效数据的筛选和相关基因表达谱的聚类，最终整合杂交点的生物学信息，发现基因的表达谱与功能可能存在的联系。

　　Microarray数据分析主要包括图象分析(Biodiscovery Imagene 4.0\Quantarray分析软件)、标准化处理（normalization）、Ratio值分析、基因聚类分析（Gene Clustering）。

　　1. 图象分析：激光扫描仪Scaner得到的Cy3/Cy5图象文件通过划格（Griding），确定杂交点范围，过滤背景噪音，提取得到基因表达的荧光信号强度值，最后以列表形式输出。

　　2. 标准化处理（Normalization）：由于样本差异、荧光标记效率和检出率的不平衡，需对cy3和cy5的原始提取信号进行均衡和修正才能进一步分析实验数据，Normalization正是基于此种目的。Normalization的方法有多种：一组内参照基因（如一组看家基因）校正Microarray所有的基因、阳性基因、阴性基因、单个基因。

　　3. Ratio分析(Ratio Analysis)：cy3/cy5的比值，又称R/G值。一般0.5-2.0范围内的基因不存在显著表达差异，该范围之外则认为基因的表达出现显著改变。由于实验条件的不同，此域值范围会根据可信区间有所调整。处理后得到的信息再根据不同要求以各种形式输出，如柱形图、饼形图、点图、原始图象拼图等。将每个Spot的所有相关信息如位标、基因名称、克隆号、PCR结果、信号强度、Ratio值等自动关联并根据需要筛选数据。每个Spot的原始图象另存文件，可根据需要任意排序，得到原始图象的拼图，对于结果分析十分有利。

　　4. 聚类分析(Clustering Analysis)：实际是一种数据统计分析。通过建立各种不同的数学模型，可以得到各种统计分析结果，确定不同基因在表达上的相关性，从而找到未知基因的功能信息或已知基因的未知功能。Gene Clustering就是根据统计分析原理，对具有相同统计行为的多个基因进行归类的分析方法，归为一个簇的基因在功能上可能相似或关联。目前以直观图形显示GeneCluster结果的程序已有人开发出来，可将抽象的数据结果转化成直观的树形图，便于研究人员理解和分析。

　　尽管基因芯片技术受到了广泛关注，但在基因表达谱分析中起着关键作用的生物信息学却没能引起大家的足够重视，认为简单人工处理一下原始数据就可以得到有价值的生物学信息，大量有价值的信息就这样被浪费和湮没了。可以肯定地说，没有生物信息学的有效参与，基因芯片技术就不能发挥最大效能。加大基因芯片技术中生物信息学的研究开发力度已成为当务之急。国内外已经进行了有益的尝试，初步开发出供芯片平台管理实验数据的软件包，就目前实际情况来看，生物信息学在基因芯片研究开发中介入的程度已经越来越深，主要涉及基因表达信息分析管理系统及其分析工具和分析方法，简单概括为以下几个方面：

　　基因表达数据库

　　基因表达数据库是整个基因表达信息分析管理系统的核心。Microarray数据库起着数据储存和查询、各种相关信息的整合的作用。Microarray数据库可以包含用户的管理信息、原始实验结果（图象文件、信号强度值、背景平均值行列号、基因号等）、各种实验参数（Plates/unigene/Sets/Clusters）、探针相关信息、 clone相关信息（基因名称、基因序列、GenBank accession号、克隆标志符（IMAGE和内部）、代谢途径标志符、内部克隆标志符）、分析处理结果、芯片设计相关的资源和数据，等等。
分析方法：

　　选择分析方法的基本标准：能够简化原始数据，结果直观，使研究者能在海量基因表达数据中解析出正确的基因表达谱和功能信息。一个理想的分析方法是建立在合理的算法基础之上的，应该能全面综合并直观地解析原始数据，修正已有数据，并从结构、序列、功能之间找到新联系。目前已有报道用于microarray数据分析的方法主要有以下几种：

　　手工分类法（Manual classification Method）

　　该方法在Botstein 实验室的Michael Eisen提出新的分析方法之前是唯一用来分析microarray数据的方法。其基本原理是通过对microarray的ratio值从大到小排序，筛出表达显著性改变的基因。结果可直观地从二维plot图得到。优点是能够有效筛选潜在的肿瘤标记基因和药物靶位点；可以构建多组基因诱导或抑制的时间表达谱。缺点是结论过于简单；很难发现更高层次功能线索；处理耗时且不能充分利用数据，也不能发现实验错误。

　　非监督聚类法(Unsupervised Clustering)又称配对平均连锁聚类分析(Pairwise average-linkage cluster analysis)。该方法是分层聚类的一种形式，非常类似系统发生分析。该方法是基于标准相关系数的计算。K -mean方法是unsupervised聚类法的一个变化，目前Stanford University 的Botstein实验室和NHGRI的Trent实验室都采用该分析方法。　

　　混合聚类法(Hybrid clustering approach)该聚类方法通过将每一数据点傅立叶变换寻找那些表达呈周期性变化的基因，比如细胞周期涉及的基因。所谓混合聚类就是先unsupervised聚类再supervised聚类。优点是可以整合以前手工聚类法得到的数据；尤其适合确认细胞周期调控的特征性表达谱。

　　神经网络方法(Neural network approach)运用自组织图（Self organizing maps）并结合supervised法进行聚类。优点是分类标准明确；优化的次序好于其它聚类法；用一种次序风格处理大量数据易于被生物学家接受。