黄芪中的主要有效成分除皂苷外就是异黄酮类化合物。异黄酮类成分具有调节免疫、抗肿瘤、抗突变、抗氧化、抗炎、抗突变抗辐射、抗心肌缺血、抗心律失常、抗病毒、抗细胞凋亡、保肝、防止动脉粥样硬化等作用，其代表成分就是毛蕊异黄酮 7-O-β-D 吡喃葡萄糖苷（即毛蕊异黄酮苷）。2010版药典才开始将毛蕊异黄酮苷收录为黄芪中有效成分含量测定项。本章实验借鉴药典中的测定方法，对不同工艺条件下获得的黄芪水提物中的毛蕊异黄酮苷含量进行考察，以期为优化芪龙胶囊和黄芪配方颗粒中黄芪的提取工艺参数提供科学基础和理论依据。
1 材料和仪器
1.1 样品
收集9组黄芪水提取物样品，黄芪饮片为济南济成堂中药饮片有限公司提供（批号18033101）。
1.2 试剂
毛蕊异黄酮苷对照品（成都瑞芬思生物科技有限公司批号M-020-170926），乙腈为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；甲酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）；超纯水。
1.3 仪器
液相色谱系统，包括日本岛津公司LC-20AT型液相色谱仪，LC-20AT岛津输液泵，CTO-20A柱温箱，SIL-20A自动进样器，SPD-20A紫外-可见光检测器；超声波清洗机KS-300E（宁波科生仪器厂）；电子天平MS205DU（梅特勒/瑞士）。
2 方法学考察
2.1 色谱条件及系统适应性试验
DiamonsiL（钻石）C18柱（250*4.6 mm，5 mm）。以乙腈为流动相A，0.2%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱，A相：0→20 min A为20→40%；20→30 min A保持40%；30→40 min A保持20%。检测波长260 nm；流速为1 mL/min；柱温35 ℃进样量为10 μL。毛蕊异黄酮苷对照品溶液以及黄芪水提物样品色谱图见图4-1与图4-2。

图4-1 毛蕊异黄酮苷对照品色谱图

图4-2 黄芪水提物样品色谱图

2.2 供试品溶液的制备
精密称定1/50重量的黄芪水提物样品（折合黄芪药材2 g）置于锥形瓶中，精密加入50 mL甲醇，超声30 min，过滤，将滤液放至水浴锅上蒸干，残渣用甲醇溶解，并定容至25 mL，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，即得。
2.3 对照品储备溶液的制备
精密称取黄芪甲苷标品5.10mg至10 mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容，摇匀，即得浓度为0.51 mg/mL的对照品储备溶液。
3 结果
3.1 线性关系考察
精密吸取 2. 3 项下对照品储备溶液 4，2，1，0.5，0.25 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到浓度为204.00，102.00，51.00，25.50，12.75 μg/mL的对照品溶液。按“2.3”项下色谱条件分别进样10 μL，利用自动积分功能测定峰面积积分值，并以峰面积积分值与浓度进行线性回归。如图3，得回归方程为：Y =25445X + 44225（r²= 0.9994）提示毛蕊异黄酮苷在12.75～204.00 μg/mL范围内线性关系良好。毛蕊异黄酮苷对照品标准曲线如图4-3所示。

图4-3 毛蕊异黄酮苷标准曲线

3.2 精密度实验
按2. 2 项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，重复进样 6 次，记录色谱图峰面积，测定毛蕊异黄酮苷含量，计算得相对标准偏差RSD为1.6% ，提示该方法精密度良好。
3.3 重复性实验
取同一黄芪样品 6份，按“2. 2”项下方法制备供试品溶液，在拟定分析条件下，精密吸取供试品溶液10 μL，测定毛蕊异黄酮苷含量，计算得RSD为1.1%，提示该方法重复性良好。
3.4 稳定性实验
按2. 2 项下方法制备供试品溶液，分别在0 h、3 h、6 h、9 h、24 h、48 h后，准确吸取 10 μL 进样分析，测定毛蕊异黄酮苷含量，计算得 RSD 为 0.6%，提示黄芪供试品溶液在48h内稳定性良好。
3.5 加样回收率实验
精密称取 6 份毛蕊异黄酮苷含量已知的黄芪水提物样品，每份折合黄芪药材 0. 5 g，分别准确加入样品中毛蕊异黄酮苷含量的50%，50%，100%，100%，150%，150%重量的毛蕊异黄酮苷标品，按2. 2 项下方法制备供试品溶液，准确吸取 10 μL 进样分析，测定毛蕊异黄酮苷含量，计算回收率，结果见表4-1。方法平均回收率为108.48%，表明该方法具有较好的回收率。

表4-1 毛蕊异黄酮苷加样回收率测定结果

样号	样品中的量/mg	加入量 /mg	测得量/mg	回收率 /%	平均值/%	RSD /%
1	1.06	0.52	1.64	111.54	108.85	2.9
2	1.06	0.52	1.64	112.08
3	1.06	1.06	2.22	109.20
4	1.06	1.06	2.24	111.02
5	1.06	1.59	2.72	104.57
6	1.06	1.59	2.72	104.67

3.6 毛蕊异黄酮苷的含量测定结果
取9组黄芪水提物按照“2.2”项下操作，制备供试品溶液，准确吸取 10 μL 进样分析，测定毛蕊异黄酮苷的含量。结果见表2。

表4-2 9组黄芪水提物中毛蕊异黄酮苷含量测定结果

批号	峰面积	含量(mg/g)
1	1123989.50	0.53
2	2707047.50	1.31
3	1947171.50	0.93
4	3573103.75	1.73
5	1824562.00	0.87
6	2767419.00	1.34
7	2077551.50	1.00
8	1677225.50	0.80
9	1725416.00	0.83

3.7 毛蕊异黄酮苷转移率测定正交试验结果
水提的毛蕊异黄酮苷转移率考察正交试验与水提的出膏率考察正交试验设计相同，即以水作为提取溶剂，把影响药材提取效果的用水量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）确定为考察因素，以上三个考查因素各分3个水平考察，见表4-3。

表4-3水提实验因素水平表

水平	因素
水平	A（用水量/倍）	B（提取时间/h）	C（提取次数/次）
1	4	1	1
2	8	2	2
3	10	3	3

毛蕊异黄酮苷转移率=各实验组黄芪提取物中毛蕊异黄酮苷含量/原黄芪药材中毛蕊异黄酮苷含量×100%。原药材中毛蕊异黄酮苷的含量按照药典的方法测得的结果为0.1425mg/g。跟据实验数据，得到水提实验中设定的不同工艺条件下的毛蕊异黄酮苷的转移率，其中因素D为误差项，作直观分析表和方差分析表，见表4-4，4-5。

表4-4 毛蕊异黄酮苷转移率考察L₉(3⁴)正交试验表

批号	A	B	C	D	毛蕊异黄酮苷转移率/%
1	1	1	1	1	37.21
2	1	2	2	2	91.77
3	1	3	3	3	65.58
4	2	1	2	3	121.62
5	2	2	3	1	61.36
6	2	3	1	2	93.85
7	3	1	3	2	70.08
8	3	2	1	3	56.28
9	3	3	2	1	57.94
K1	194.56	228.91	187.34	156.51
K2	276.83	209.41	271.33	255.70
K3	184.30	217.37	197.02	243.48
优水平	2	1	2	2
R	92.53	19.50	83.99	99.19

表4-5 毛蕊异黄酮苷转移率考察方差分析表

方差来源	离差平方和	自由度	F	显著性
A	1715.05	2	1.50	-
B	64.09	2	0.04	-
C	1407.78	2	1.13	-
方差来源	离差平方和	自由度	F	显著性
D	1950.20	2	-	-

注：F_0.1（2,2）=9，F_0.05（2,2）=19，*为有显著性，-为无显著性。
从正交试验结果可知：水提实验中，各因素对毛蕊异黄酮苷转移率的影响大小顺序为：A（用水量）>C(提取次数)>B(提取时间)；每个因素3水平之间的趋势为A₂>A₁>A₃，B₁>B₃>B₂，C₂>C₃>C₁，直观分析得提取工艺为A₂B₁C₂，即加水8倍量，提取2次，每次1h。表4-5的方差分析结果表明： A、B、C三因素的对毛蕊异黄酮的转移率影响都无统计学差异(P<0.05)。
3.8 综合评分计算正交试验结果
采用黄芪甲苷和毛蕊异黄酮苷提取转移率、出膏率3项考察指标的综合评分的方法，优选水提实验的提取工艺条件。评分标准：综合考虑黄芪甲苷转移率、毛蕊异黄酮苷转移率和出膏率，总评分按黄芪甲苷转移率占40%、毛蕊异黄酮苷转移率占40%和出膏率占20%计算。计算公式为：综合评分=黄芪甲苷转移率*40+毛蕊异黄酮苷转移率*40+出膏率*20。跟据实验数据，得到水提实验中设定的不同工艺条件下的综合评分，其中因素D为误差项，作直观分析表和方差分析表，见表4-6，表4-7。

表4-6 综合评分计算L₉(3⁴)正交试验表

试验号	A	B	C	D	黄芪甲苷转移率/%	毛蕊异黄酮苷转移率/%	出膏率/%	综合评分
1	1	1	1	1	34.12	37.21	20.38	32.61
2	1	2	2	2	51.54	91.77	30.19	63.36
3	1	3	3	3	89.41	65.58	39.46	69.89
4	2	1	2	3	268.30	121.62	35.47	163.06
5	2	2	3	1	92.88	61.36	34.29	68.55
6	2	3	1	2	56.56	93.85	28.74	65.91
7	3	1	3	2	99.83	70.08	28.49	73.66
8	3	2	1	3	65.10	56.28	31.40	54.83
9	3	3	2	1	77.56	57.94	38.20	61.84
K1	165.86	269.33	153.35	163.00
K2	297.52	186.74	264.62	202.93
K3	190.33	197.64	212.10	287.25
优水平	2	1	2	3
R	131.66	82.59	111.27	124.25

表4-7 综合评分计算方差分析表

方差来源	离差平方和	自由度	F	显著性
A	3269.20	2	1.38	-
B	1342.15	2	0.45	-
C	3050.29	2	1.25	-
D	2707.11	2	-	-

注：F_0.1（2,2）=9，F_0.05（2,2）=19，*为有显著性，-为无显著性。
从正交试验结果可知：水提实验中，各因素对综合评分的影响大小顺序为：A（用水量）>C(提取次数)>B(提取时间)；每个因素3水平之间的趋势为A₂>A₃>A₁，B₁>B₃>B₂，C₂>C₃>C₁，直观分析得提取工艺为A₂B₁C2，即加水8倍量，提取2次，每次1h。表4-7的方差分析结果表明：A、B、C三因素对综合评分的影响都无统计学差异(P<0.05)。
4 讨论
本章实验借鉴药典中测定黄芪药材中毛蕊异黄酮苷含量的方法，利用紫外-可见光检测器的高效液相色谱仪测定黄芪水提物中毛蕊异黄酮苷的含量。与药典中方法测得的结果相比，本实验测得的结果除色谱峰分离度稍差外，其他方法学考察指标显示良好。
从毛蕊异黄酮苷转移率测定正交试验结果来看，第4组实验毛蕊异黄酮苷转移率最高，这也是正交结果分析中最佳提取工艺，即加水8倍量，提取2次，每次1小时。本结果与上一章实验中第四组黄芪水提物中黄芪甲苷的转移率最高结果一致，但其他组别毛蕊异黄酮苷的转移率高低顺序与上一章黄芪甲苷的转移率高低顺序并不一致，这说明毛蕊异黄酮苷和黄芪甲苷对提取工艺的要求并不完全一致。同一种原药材，加工成不同功效的药物，那么发挥药效的物质也有可能不同，因此相应的提取工艺也是需要根据药效物质适时调整的。另外，用水量在设置的三个因素中对毛蕊异黄酮苷的转移率影响最大，但仍无统计学差异(P<0.05)，说明用水量、提取次数、提取时间三种工艺的改变对黄芪水提物中毛蕊异黄酮苷的含量无显著性影响。
从综合评分计算正交试验结果来看，第4组实验综合评分最高，这也是正交结果分析中最佳提取工艺，即加水8倍量，提取2次，每次1小时。用水量在设置的三个因素中对综合评分影响最大，但仍无统计学差异(P<0.05)，说明用水量、提取次数、提取时间三种工艺的改变对黄芪水提工艺的综合评分无显著性影响。
综合出膏率、黄芪甲苷和毛蕊异黄酮苷的含量得出综合评分来优选黄芪水提的最佳提取工艺，能够从化学成分的角度来客观全面地评价和研究黄芪水提的关键环节，这也为芪龙胶囊和黄芪配方颗粒水提环节工艺的优化提供借鉴和指导。

参考文献

陈建真,吕圭源, 叶磊, 等.黄芪黄酮的化学成分与药理作用研究进展. 医药导报, 2009, 28(10): 1314-1316.
赵四清,周日宝, 陈胜璜, 等.不同的产地加工方法对中药材金樱子质量的影响. 湖南中医学院学报, 2005, 25(3): 21-22.

附件：

HPLC法测定黄芪水提物中的毛蕊异黄酮苷含量.docx