主题：【已应助】流式中抗体的选择

楼主可以参考网上相关资料：
一、流式抗体选择要点：

特异性靶蛋白：确定要检测目的细胞特异性靶蛋白。

种属：严格按照待测样本种属选择抗体。

应用领域：可用于流式实验，说明书中明确标注经FCM实验测试，最好有实验数据图和用量说明;若还可做荧光染色等多用途则更佳。

抗体克隆号：同一抗体多个克隆号的情况下，可以选择荧光标记种类最多的那个克隆;若文献中有被引用，首先选择被引用的抗体克隆号。

尽量选择直接标记的抗体：直接标记抗体是指荧光素标记的单克隆或多克隆一抗，一步染色，操作方便，影响因素少，结果准确。

同型对照：与一抗的来源，Ig分型和标记完全一致，使用时与一抗相同的浓度。

二、标记方法的选择——直标or间标(Biotin)根据抗原表达丰度来选择：

直标抗体(一步法)：待测抗原表达丰度高的尽量选择直标抗体。

间标抗体：待测抗原表达丰度低的要考虑选择间接标记抗体(无荧光一抗 + 荧光二抗——两步法)或生物素标记抗体(无荧光一抗 + 生物素标记二抗 + 荧光标记链霉亲和素——三步法)。

三、荧光抗体的选择：

1、确定流式细胞仪的参数配置

在设计流式方案前，根据可能需要同时检测指标的多少数量，先确定需要在哪台流式细胞仪检测，对该仪器的参数配置，要了解以下几个方面信息：

激光器：常见的流式细胞仪有355nm、488nm和640nm三个激光器，但有些机器在购买时因某些原因，只装了一个488nm激光器，所以需要注意型号相同的机器也未必激光配置相同。

滤光片：也就是有几个检测通道，这决定了你最多可以同时检测几个指标。

仪器的具体型号：有助于再次确定检测通道。因为同一个荧光在不同的流式细胞仪上检测，有时候检测通道也是不一样的。

2、荧光的选择建议

荧光本身有强弱之分，可视抗原表达强弱及分群情况选择合适的荧光。抗原表达弱或分群不明显的建议选择强荧光例如：PE、APC;反之，抗原表达强或分群明显的建议选择最常用的弱荧光例如FITC。

常用荧光强弱排序程度为：PE>APC>PE-Cy5>PerCP-Cy5.5>FITC。

类似荧光的取代：Alexa Fluor、eFluor等这些荧光非常明亮，对激光稳定性好，对PH 值不敏感，具有水溶性。如Alexa Fluor488与FITC检测通道相同，但是荧光强度和光敏感上，前者明显优于后者，因此可以用Alexa Fluor488取代FITC。

可以参考：
流式细胞术应用领域的日益广泛，流式抗体及荧光标记产品的种类、数量也在不断增多，加 上多色分析实验方案需求的增长，逐渐产生了抗体难选择、荧光难搭配等问题，给实验顺利开展带来了诸多困扰。流式抗体如何选择，也成为了流式技术是否能被成功应用的关键因素之一。如何从众多的流式厂商中筛选出最适合您的抗体，是每个科研工作者所面临的 棘手问题。

流式抗体如何选择，主要可以从以下六个方面进行考虑：

第一： 满足所需抗体的基本要求 （抗原、识别种属、荧光标记、能用于流式实验）

  流式抗体本身也是抗体，所以首先要满足抗体选择的最基本条件：

①  目标蛋白特异性 ：确定目的细胞的特异性表面标记或者胞内标记，知道您要检测什么；

② 严格按照样本种属来源进行选择，流式抗体基本无法进行种属交叉反应；

③ 可用于流式实验 ，说明书中明确标注经FC 实验测试，最好有实验数据图和用量说明 ；

④ 抗体克隆号一般不需要关注，有特殊需要的情况下可以参考文献上提到的克隆；同一抗体多个克隆号的情况下，可以选择荧光标记种类最多的那个克隆。

第二： 确定流式细胞仪的配置（激光器 探测器）

  在设计流式方案前，根据可能需要同时检测指标的多少，先确定需要在哪台流式细胞仪上机检测，对该仪器的参数配置，要了解以下几个方面信息：

① 有几个激发光？常见的流式细胞仪有 488nm 和 635nm 两个激光器，但有些机器在购买时因某些 原因 ，只装了一个激光器，需要注意，所以型号相同的机器也未必激光配置相同；

② 有几个滤光片？也就是有几个检测通道，这决定了你最多可以同时检测几个指标；
③ 了解清楚仪器的具体型号，有助于再次确定检测通道。因为同一个荧光在不同的流式细胞仪上检测有时候检测通道也是不一样的。

第三： 荧光抗体的选择建议 （荧光素种类繁多， 新荧光素层出不穷）
  流式检测的抗体必须要求都有荧光标记，在选择过程中可参考以下几方面建议
① 尽量选择直接标记有荧光的抗体，间接标记二抗会增加实验步骤，清洗多次造成细胞浪费，也会影响实验的准确性；
② 荧光本身有强弱之分，可视抗原表达强弱及分群情况选择合适的荧光。如抗原表达弱或分群不明显的建议选择强荧光 PE ；反之，抗原表达强或分群明显的建议选择最常用的弱荧光 FITC 即可（常用荧光强弱排序为 ：PE>APC>PE-cy5>Percp-cy5.5>FITC ）；
③ 可以尝试选择新型荧光 Alexa Fluor、eFluor 等。因为这些荧光非常明亮，对激光稳定性好 ，对PH值不敏感，具有水溶性。（如Alexa Fluor488 与 FITC 检测通道相同，但是强度和淬灭时间上，前者明显强于后者 ）

第四：多色荧光搭配的原则 （避免荧光补偿，又能在现有配置的流式仪器上检测）
  多色分析方案中荧光抗体的选择和搭配，会受到很多因素的制约，是一个难点：
① 每个检测通道只能选择 1 种荧光素，各通道之间的荧光素可以随意搭配（如FL1 选择了 FITC 标记的抗体，就不能再选择 Alexa Fluor488 标记的抗体；而同组实验的其余抗体选择 PE 或者 APC 标记，都是可以随意组合的）；
② 所选各种荧光素光谱的重叠应当尽量减少，否则将会导致补偿难调。例如 ，PE-cy5 与 APC 同时标记，将会导致补偿过度，需换成 PE-cy5.5 或 Percp-cy5.5。最常用的4 色荧光搭配是：FITC、PE、Percp-cy5.5、APC ；
③ 多色分析往往会因个别抗体荧光素种类极少而受到限制，需要同时参考多家抗体公司的产品进行方案设计。因此如遇 5 色以上分析需求，建议咨询我们公司专业人员。

第五：抗体量的确定（尽为参考，请尽量参见厂家产品说明书）
同一个产品通常会提供多个规格供您选购，可以根据实验的具体样本量确定剂量 ：                                 
① 通常情况下流式检测一次的样本量为 1X10  个细胞，流式抗体所说的检测用量都是以这个细胞数量为标准的 ，建议对样本做细胞计数，以保证抗体标记效果最佳；
② 以test 为计量单位的抗体，按照总体积计算出每次加入多少 ul 抗体即可；
③ 以 ug 为计量单位的抗体，需要根据说明书每次抗体加入多少 ug 先算出能使用的次数，再通过总体积算出每次加入多少 ul 抗体。

第六：同型对照抗体的选择 （是非常严格的事情，很多人忽略）
同型对照 （Isotype Control ），是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，是真正意义上的流式阴性对照。它不但可以用来设定流式细胞仪的电压，而且还可以帮忙省去繁琐的竞争封闭步骤。
① 同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型及亚链、相同荧光标记的免疫球蛋白，也要求使用相同剂量。同型对照一定要选择准确，通常在荧光一抗的说明书中，厂家会直接写出同型对照抗体的货号；
② 如果是纯化的一抗加荧光标记的二抗，那么应该选择与一抗相对应的同型对照抗体（如样品管为 ：纯化的 CD3 PE 标记的二抗 样本；则对照管为：纯化的同型对照  PE 标记的二抗 样本）；
③ 有些抗体在细胞表面或胞内表达不高，而跟其类似的抗原却非常多，那么同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性，就会造成同型对照表达高于抗体阳性表达的现象。这时推荐使用其他阴性对照，如空白对照等。
④ 对流式不熟悉的人，或者胞内因子、信号蛋白检测时，强烈建议使用同型对照；而对于熟悉流式操作，清楚知道抗体表达情况的用户，可以考虑省去同型对照。

流式抗体的选择：
1. 流式抗体本身也是抗体，所以选择流式抗体一定要满足抗体选择最基本的条件：目标蛋白特异性，反应种属以及应用实验。
2. 流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。在流式实验过程中，尽量减少实验工序和过程，以保证实验的真实和准确性。因此在条件允许的范围内，建议尽量用直接标记的抗体进行实验而不去做间接标记。
3. 流式抗体荧光标记的选择：如果实验中检测单一指标：不同荧光标记在不同的仪器上强度不同。FACS Calibur仪器为例：PE ＞APC ＞PE-Cy5 ＞PerCP ＞FITC ＞PerCP-Cy5.5，通常来说，PE最强，适用于弱表达抗原。FITC强度较弱，适用于强表达抗原，使用范围比较广。用户需根据检测的目标蛋白进行具体选择。如果同时检测多个指标：确认流式细胞仪能检测多少个通道：流式抗体每个通道只能选择1种荧光素。各个通道之间的荧光素可以随意搭配。如：实验者同时检测三个指标，可以在图1中绿色、黄色和红色三个通道中各选一个适当的荧光素标记，FITC、PE和PE-cy5。切忌所有指标选择同一个通道的荧光标记，以防止荧光的重叠和相互干扰，影响最后结果。因此，流式细胞仪的通道越多，同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多。常用荧光标记包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。
流式抗体使用注意事项：
1、建议实验细胞的数量和抗体的比例要适当。细胞过量或抗体过量都可能使实验结果受影响，因此需要优化试验条件。注：不同的流式技术对抗体的需求量有较大差异，例如传统流式细胞术（采用鞘液流系统）需要1×106个细胞为起始上样量，抗体用量为10μl，而微流式细胞术则只需5×105个细胞，抗体用量减少到5μl。
2、直标的流式抗体应该4℃避光保存，不要冷冻。
3、尽量选择经实验验证的流式抗体，以保证实验结果。