油脂中加入适量抗氧化剂，可抑制微生物生长繁殖，从而有效防止油脂因空气中的氧化发生酸败而引起变质，延长保质期。特丁基对苯二酚（TBHQ）属酚类油溶性抗氧化剂，特别适用于植物油中，是色拉油、调和油等首选的抗氧化剂。相当多的动物实验表明，抗氧化剂具有一定的毒副作用，因此我国食品安全国家标准食品添加剂使用标准GB 2760-2014（04.007）规定，TBHQ可用于食用油脂、油炸制品、坚果罐头、方便面、饼干、腌制肉制品、膨化食品等，最大使用量为0.2 g/kg。

前段时间单位收到了某企业送来的的包括葵花籽油、大豆油、花生油在内的十多个食用油样品，需要检测特丁基对苯二酚（TBHQ）、叔丁基-4-羟基茴香醚（BHA）、2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）、没食子酸丙酯（PG）四种抗氧化剂，采用的方法标准是《SN/T 1050-2014 出口油脂中抗氧化剂的测定高效液相色谱法》。

前处理过程完全按照该标准：称取1 g样品于离心管中，加入5 mL乙腈饱和的正己烷（用于溶解样品），涡旋混匀2 min使样品完全溶解，再加入10 mL正己烷饱和的乙腈（用于提取样品中抗氧化剂），涡旋混合1 min，倒入分液漏斗中，静置分层，将下面乙腈层转入旋转蒸发瓶中。再按照上述操作用正己烷饱和乙腈提取两次，合并乙腈于旋转蒸发瓶内。在40℃下，将乙腈提取液旋转蒸发至近干，将浓缩液转至刻度管中，用异丙醇定容至2 mL，过0.22 um有机滤膜后供UPLC分析。

液相色谱条件：色谱柱:Waters BEH C₁₈（1.7 μm，50mm×2.1mm）；柱温：30℃；流速：0.4 mL/min；进样量：2 μL；检测波长：280 nm；流动相A：乙腈；流动相B：0.1%的甲酸水溶液。梯度洗脱程序：0~0.5min，20% A；0.5~6. 0 min，20%~100% A；6. 0 ~7. 0 min，100%A，7 ~7.1min，100% A~20% A，7.1 ~8.0min 20% A。

图1 四种抗氧化剂标准溶液色谱图（5 ug/mL）

图2 某四级葵花籽油样品色谱图

图3 某一级葵花籽油样品色谱图

图4 四级葵花籽油样品稀释50倍后加入5 ug TBHQ的色谱图

某四级葵花籽油样品色谱图在2 min处有很大的色谱峰（见图2），和TBHQ标准品（图1）进行比对，发现保留时间重合的非常好，经计算该样品TBHQ含量为0.5 g/kg，超过了GB 2760关于TBHQ的限量值0.2 g/kg，样品平行性非常好，跟随样品的质控添加平均回收为93%，完全符合该标准要求。由于涉及不合格样品判定，出具报告时需要更加谨慎。该标准前处理方法比较简单，特别是该“超标样品”油颜色比较深，其它颜色比较浅的一级、二级食用油等样品TBHQ则为未检出，TBHQ保留时间处确实没有色谱峰（图3），怀疑是不是该样品由于颜色比较深可能前处理过程中没有去处色素等杂质干扰，造成[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p]液相色谱[/url]出现假阳性的情况。

一般出现这种情况，如果还用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p]液相色谱[/url]法进行判定的话，一般可以选择以下三种方式：①用二极管阵列检测器进行全波长扫描，看标准品和阳性样品TBHQ吸收波长是否一致；②改变流动相梯度程序，看标准品和阳性样品TBHQ保留时间变化是否一致；③采用标准加入法，即在阳性样品中加入一定量TBHQ标准品，看色谱峰重合性和峰面积增加是否符合理论值。由于单位这台UPLC没有配置二极管阵列检测器，①这种方式实现不了；通过改变流动相梯度程序，发现阳性样品TBHQ保留时间依然和标准品重合性很好，②也判定不出是否是“假阳性”；采用③方式，分别在两个阳性样品中加入TBHQ标准品，色谱图见图4，TBHQ峰型完好没有出现分叉，峰面积增加值和理论加入值基本吻合，也不能做“假阳性”判定。

基于以上结果，能否做出不合格判定？样品实际检测结果如何？

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2022/4/13 17:31:12 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

后续复核方法：

上述三种方法基本就是液相色谱法对阳性样品进行判定最容易实现的方式了，如果用完这三种方式仍怀疑是“假阳性”，则需要用液质检测特征离子对进行判定，查阅另一个国家标准《GB5009.32-2016 食品安全国家标准食品中9种抗氧化剂的测定》，该标准第二法为“液相色谱串联质谱法”，但这里面却没有包含TBHQ。通过查阅一些食用油抗氧化剂检测文献，TBHQ是可以用液质检测的，结合相关文献提供的离子对，使用Waters XEVO TQMS三重四级杆液质联用仪对TBHQ进行质谱参数优化，得到的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源( ESI ^- ) ；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测( MRM)；毛细管电压：2.3 kv；离子源温度：150℃；去溶剂气温度：500℃；去溶剂气流量：1000 L /h；定性、定量离子对及碰撞能量如表1

表1 TBHQ的质谱参数

分析物

锥孔电压/V

母离子/(m/z)

子离子/(m/z)

碰撞能量/V

TBHQ

165

108﹡

149

TBHQ标准品色谱质谱图见图5

“阳性样品”色谱质谱图见图6

“阳性样品”加入TBHQ标准品色谱质谱图见图7

通过比较色谱质谱图，很明显可以看出液相色谱检测出的TBHQ“阳性样品”经液质确认为“假阳性”，但由于GB5009.32-2016第二法液质法中没有TBHQ，无法出报告，只能求助气质组同事，利用GB5009.32-2016第三法气质法出具“假阳性”判定报告。

图5 TBHQ标准溶液（0.5 ug/mL）MRM色谱图

图6 某四级葵花籽油“阳性样品”MRM色谱图

图7 “阳性样品”加入TBHQ标准溶液MRM色谱图

小结

高效液相色谱法一般只能通过保留时间进行定性，遇到样品基质复杂而前处理不能有效去除杂质的情况（如本次实验中的四级葵花籽油），极有可能出现杂质和目标物在同一保留时间出峰，很难确定到底是不是目标物。这时出具“阳性样品”判定报告一定要谨慎，可以通过上述三种方式对该样品进行确认；如果目标物能够离子化，质谱有响应，用串联液质对可疑“阳性样品”进行确认更加方便、准确。现在与液质联用仪、气质联用仪有关的标准越来越多，质谱逐渐成为大型实验室标配，国家很多农兽药监测任务都要求对色谱法检出的“阳性样品”要进行质谱法确认，避免“假阳性”，这就对实验人员提出了更高的要求，需要结合多种技术手段进行“阳性样品”确认。

原文标题:记一次食用油中抗氧化剂TBHQ假阳性判定

原文作者:户江涛（黑龙江省农垦科学院测试化验中心）

原文链接：https://bbs.instrument.com.cn/topic/7832037

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2022/4/13 17:33:09 Last edit by p3299836