1、? 前言

米酵菌酸是一种强毒性物质，美国《食品毒理学手册》指出人体血液中米酵菌酸素含量达到200~300微克/升，即可达到致死剂量，人群中毒事件提示剂量反映经口摄入含31毫克米酵菌酸素的食物可导致死亡。米酵菌酸又是强耐热毒素，120℃高温处理1小时毒性仍然不被破坏，因此普通家庭的烹饪方式和食品加工处理过程难以去除或者破坏米酵菌酸，由此引起的食物中毒目前尚无特效救治药物，病死率可达40%以上。

引起中毒的主要食品为发酵玉米面制品、变质银耳及其他变质淀粉类（糯米、小米、高粱和马铃薯粉等）制品。相关研究指出，湿淀粉、泡发的木耳（银耳）等食品在高温潮湿的环境下容易受椰毒假单胞菌污染而产生米酵菌酸毒素。

我国近几年发生的中毒大部分与某些地方特色食品有关，北方以酵米面制作的臭碴子、酸汤子、格格豆等为主，南方多以酵米面制作的汤圆和以糯米泡制后做成的吊浆粑、河粉等食品为主。

有鉴于上述情况，国家监管部门（食药、疾控系统等），加大了易发米酵菌酸毒素中毒食品的监测监管力度。多个相关的国家标准相继出台执行，严格规定了实验室针对食品中的米酵菌酸毒素的检测方法（包括前处理），制定了相应的食品卫生标准，确保食品的安全。

例如：GB5009.189—2016 食品安全国家标准食品中米酵菌酸的测定，该标准规定了银耳及其制品、酵米面及其制品等食品中米酵菌酸的测定方法。其中，试样制备的前处理方法提到了两种，分别是：固相萃取法和液-液萃取法。

由于固相萃取法操作比较简单，耗时短，消耗的试剂少，安全高效。而液-液萃取法使用大量的三氯甲烷、石油醚有机试剂进行提取、萃取，不仅对操作人员身体伤害大且前处理时间长，过程复杂，回收率相对会降低。从实验操作性、人员安全性、成本效益等比较固相萃取法比液-液萃取法更优越。

本文将重点探讨固相萃取法在米酵菌酸测定实验中的应用。简单介绍了方法的基本步骤，对目前常用的固相萃取的设备的优点和不足进行着重研究。探索出一种操作更简便、更节省人工的方法以及购买和维护使用成本更低的固相萃取辅助装置，提高实验的准确率和回收率。

二、米酵菌酸前处理方法（固相萃取法）的介绍、研究和探讨

2.1 样品前处理方法

提取：干试样经粉碎过?0.425mm筛，鲜(湿)试样经剪碎、匀浆后，称取10g(精确至0.01g)置于50mLPE管中，加入20mL甲醇-氨水溶液，涡旋1分钟，超声提取30分钟，1.1万转离心20分钟。

净化：吸取10mL离心后的上清液慢速过5mL甲醇和5mL水活化的固相萃取柱（WATERS OASIS MAX小柱），再用6mL甲酸-甲醇洗脱，收集洗脱液于40±5℃氮吹至干，加入1.00mL甲醇，涡旋溶解，混匀，1.1万转离心20分钟，上清液经0.22μm微孔有机滤膜过滤后进行HPLC分析。

2.2详细的实验步骤（以传统工艺制作的湿河粉为样本）：

2.3 固相萃取法样品前处理中的困境和探讨

2.3.1困境：

从以上前处理的步骤和方法中可以看出：固相萃取法最大的困难在于样品过柱和洗脱的环节，有些样液很难按照国标要求的那样（形成液滴，间断的通过）顺利的通过小柱的填充物。

2.3.2探讨：

样液过柱或洗脱困难，会降低结果的准确性和回收率，有些样品完全不能过柱，则会导致实验失败。目前实验室常用的固相萃取装置分为手动固相萃取装置和自动固相萃取设备。它们在带来便捷性的同时，也存在一些不足。不足主要体现以下几方面：

2.3.3手动固相萃取装置的不足

?? 装置的框架和高度是固定的，所以废液瓶和收集瓶的预留的位置是固定的，不能根据需要调整高度，来灵活放置大小合适的废液瓶或者收集瓶，如果溶液量大的时候，需要中途更换废液瓶或者收集瓶，操作麻烦。

?? 洗脱液收集瓶体积受限制，如果洗脱液体积大，要分几瓶来装，后期需要合并后再氮吹，操作麻烦，影响回收率。

?? 架子不能叠加，不能实现同时过两层小柱。

?? 依据柱的不同容量购买不同孔径的试管架；活化用的的甲醇等液体、样品溶液会腐蚀试管架、托盘；因不同柱、不同样品过滤效率不同，不能实时观察液体液面，只能每支拿出来观察，在移动柱时液滴容易污染其它样品。小容量柱可以直接插进PE管或玻璃管，但加入一定的洗脱液后，柱前端会浸入柱后洗脱液中，造成样品污染。如果萃取柱容量较大，不能插进PE管或玻璃管，则需用试管架手工搭建简易的洗脱装置，自己搭建的支架容易跌落、倒泻、污染样品，给实验造成很多困难。

?? 吸耳球或者注射器手动加压，需要手指挤压，压力有限。难于对粘稠的样液起作用。手部肌肉也容易疲劳，操作员工作强度很大。

?? 真空泵抽真空给样液施加负压。对于特别粘稠的样液，比如湿米粉、肥肉等，真空抽滤压力不够，很难完成过柱。并且需要更换接受管架，闲置的孔位需要密闭。多管同时抽的时候，要时刻关注动态，抽滤好的位置需要关闭。操作比较繁琐，劳动强度较大。对于比较容易过柱的样品，稍微一抽，样液就快速通过填充物，待测成分来不及被填充物吸附。难于控制过柱速度，影响回收率。

2.3.4自动固相萃取设备的不足

·上样体积固定，过于死板，不能满足不同的上样体积，每次上样体积太小只有5mL，最大8mL，大体积上样需要分多次上样，过于麻烦。

?? 上样用的样品瓶是专用的，跟一些前处理用的样品瓶不能通用。有时候处理的样品溶液体积过大，需要分几瓶来装；并且有时候前处理出来的液体体积不是很固定，如果要全部上样的话，在仪器上难以通过设置程序自动实现。

?? 洗脱液收集瓶体积固定，如果洗脱液体积大，要分几瓶来装，后期需要合并后再氮吹，操作麻烦，影响回收率。

?? 需要用专用的收集瓶，氮吹需把洗脱液转移到氮吹瓶中，不能直接用于氮吹，转移增加洗涤收集瓶内壁的洗脱液体积，增加氮吹时间和氮气用量。增加转移操作步骤，易造成目标分析物质损失，回收率下降。

每次实验所用固相萃取小柱也是需要固定的，如果实验需要过两层小柱，是没办法在仪器上实现这个操作。

*? 利用柱塞加正压，电机按压柱塞，力量足够。但是，由于程序控制，还需要转移并固定小柱，效率比较低。有时小柱放置不够牢固或者歪斜，也会压下去导致样液损毁，无法用于考核样等重要样品。另外，通道的数量一般比较少，影响工作效率。管路的污染，也是需要认真面对的问题。虽然有清洗步骤，但也无法完全排除管路的交叉污染。

*? 利用柱塞泵给样液加正压，存在密封问题，每个小柱需要单独和管路密封，操作繁琐效率低。管路交叉污染也可能存在，清洗管路也需要耗费人力和物力，增加使用成本。同样，通道的数量也有限，很难在大规模的样品的情况下来采用。

*? 购买和使用成本高。对于一些小的或者预算有限的实验室来说，无力负担。

三、新的方法和固相萃取装置的研究探讨

3.1 研究的基本原则

对于以上存在的问题，本篇致力于研究一种全新的方法和装置—手动固相萃取装置和固相萃取过小柱正（增）压枪，来帮助实验人员更简便高效地进行固相萃取前处理。这种方法和装置，能保证样液的安全，保证待测成分的回收率。同时价格不高，省、市、县和基层实验室都有能力购买使用。

3.2 手动固相萃取装置

3.2.1、可以多层小柱同时层叠使用，其间的次序可以任意更换。

3.2.2、可以简便更换废液盘和接收管。

3.2.3、可以实时观察到每位小柱中样液过柱的进度。

3.2.4、小柱与小柱之间，小柱与接收管之间重叠交叉，任意调整高度。减少样液挂壁损失。避免了样液外泄风险。

3.2.5、定位准确，只要按要求放置到位，就自动准确定位。效率高，样品安全。

3.2.6、不锈钢材质，方便清洁，坚固、耐腐蚀。

3.2.7、对于大多数的样品，无需加压，重力过柱即可。

3.2.8、小柱的活化、样品溶液过柱、洗脱等操作方便。

3.3 固相萃取过小柱正（增）压枪

3.3.1、有足够的压力，促使样液顺利过柱，保障较好的回收率。压力大小可调，满足不同的小柱填充物和基质不同的样液。

3.3.2、兼容不同大小的小柱。

3.3.3、密封性操作简单便捷，重复性好。

3.3.4、避免了交叉污染的问题，保证了样液的安全。

3.3.5、避免了电力的损耗和触电的风险。

3.3.6、价格便宜，节省购买成本。

3.3.7、产品简单牢固耐用，几乎不用售后维护，节省了售后花费；

3.3.8、操作简便，人员操作的劳动强度低，节省人力成本。

3.4 可行性分析

以上两款装置，比较好地解决了固相萃取法前处理中碰到的问题。具体来说，就是较大的简化了萃取的步骤：

3.4.1从小柱的活化到溶液过柱，再到淋洗和洗脱，一气呵成，减少了倾倒废液，更换接受管等繁琐的操作。

3.4.2 对于重力过柱和压力过柱，可以较好地兼顾。对于过滤的速度，可以人为地调节把握，既提高了回收率又提高了效率。

3.4.3 很方便的观察每位样液液面，实时地掌握进度。

3.4.4 减少了清洗管路的步骤，减少了样液被污染的风险。

3.4.5 诚如上面所阐述的，节省了购买和使用的成本，有利于满足较大范围的实验室的需求。

通过客户的实际使用和反馈，该方案获得了较满意的答复。从总体上来说，该方案和相关的装置还是具有一定进步性的，较大程度地改善了米酵菌酸毒素测定的固相萃取法的前处理工作。有一定的推广和借鉴的价值。

如果，你也在工作中碰到了类似的问题，希望本方案对你的工作有裨益。也欢迎批评指正不足，共同探讨，进一步完善，一起进步。

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附件：

GB5009.189—2016 湿淀粉制品中米酵菌酸测定的前处理方法.pdf